基于整合藥理學和轉錄組學的天龍咳喘靈抗特發性肺動脈高壓可行性分析及作用機制

林范杰，李東蕾，林肯，陳少琪，盧文菊

1.呼吸疾病國家重點實驗室，國家呼吸系統疾病臨床醫學研究中心，廣州呼吸健康研究院，廣州醫科大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510030；2.廣州醫科大學，廣東 廣州 510030

特發性肺動脈高壓（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）是一種罕見的肺血管增殖性疾病，病理特征為叢狀病變、肺小動脈原位血栓形成及肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）過度增殖與抗凋亡，最終可演變為右心衰竭。IPAH起病隱匿，臨床表現多以疲勞、虛弱、呼吸短促、心絞痛和暈厥為主。結合現代醫學理論，中醫認為IPAH的關鍵病機在于心陽虛衰，病性證素主要為氣滯、痰阻和血瘀，證型主要為大氣下陷證、血瘀證、心氣虛證和肺氣虛證。但針對其辨證施治的醫案記載甚少，缺乏易推廣的中醫療法。另外，IPAH目前尚無法治愈。因此，尋找有效的抗IPAH藥物具有重要意義。

天龍咳喘靈是國家級名老中醫邱志楠教授根據“溫腎化痰、活血逐瘀”學術理念研發的制劑，在肺病的基礎實驗與臨床試驗中已取得顯著成效。天龍咳喘靈由10味藥組成，方中熟附子有振奮腎中元陽，復其氣化衛外之能；青天葵兼治痰瘀熱，消痰解毒化瘀又不傷陰血耗氣；炙麻黃、款冬花溫肺平喘，擅治久咳久喘；法半夏溫化痰飲、燥濕降逆；五味子斂肺而滋腎；魚腥草、黃芩清肺瀉火，清熱燥濕；芥子、細辛溫肺平喘，祛伏寒利肺。藥理學研究表明，天龍咳喘靈能夠顯著提高慢性低氧性肺動脈高壓大鼠血漿一氧化氮（NO）含量和一氧化氮合成酶（NOS）活力，減輕肺動脈內皮細胞的損傷，降低肺動脈壓力。此外，還能抑制哮喘小鼠肺組織高表達的磷酸化信號轉導及轉錄激活子3蛋白分子，而該分子可作為轉錄因子啟動某些與血管平滑肌增生肥大相關基因的表達。可見，天龍咳喘靈的功效與IPAH疾病特點相契合，顯示天龍咳喘靈用于抗IPAH具有研究價值和開發潛力。因此，本研究采用整合藥理學和轉錄組學技術系統性探究天龍咳喘靈抗IPAH的可能作用機制，為IPAH的臨床治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 天龍咳喘靈活性成分獲取與篩選

通過TCMSP（https://tcmsp-e.com/）檢索半夏、款冬花、附子、魚腥草、北五味子、黃芩、芥子、細辛和麻黃的化合物信息，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為條件篩選藥物活性成分。因TCMSP未收錄青天葵，故利用本草組鑒（HERB，http://herb.ac.cn/）數據庫獲取青天葵的活性成分。

1.2 天龍咳喘靈活性成分靶點預測

通過HERB數據庫獲取每個活性成分對應的靶點信息；利用PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取各活性成分的簡化分子線性輸入規范（simplified molecular-input line-entry system，SMILES）并依次導入SwissTargetPrediction數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）進行靶點預測，選擇物種為“Homo sapiens”，以Probability≥0.5的靶點蛋白作為活性成分作用的靶點。兩者進行合并、去重，通過UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）對靶點蛋白名稱進行標準化。

1.3 疾病靶點收集

以“idiopathic pulmonary arterial hypertension”為關鍵詞，檢索GeneCards（https://www.genecards.org/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）數據庫，所得結果合并、去除重復，將篩選出的靶點基因名稱通過UniProt數據庫進行規范。

1.4 藥物-成分-疾病-靶點網絡構建及分析

利用OmicShare平臺（https://www.omicshare.com/）繪制天龍咳喘靈活性成分靶點和IPAH靶點的維恩圖，存在交集的共同靶點可能是天龍咳喘靈抗IPAH的關鍵靶點。將天龍咳喘靈及其藥味名、疾病名、關鍵靶點及對應的活性成分導入Cytoscape3.8.0軟件，構建藥物-成分-疾病-靶點網絡并進行網絡拓撲學分析，設置參數以節點大小反映其度值大小。

1.5 蛋白相互作用網絡構建及分析

將關鍵靶點導入STRING數據庫（https://stringdb.org/）構建蛋白相互作用（PPI）網絡，設置蛋白種屬為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為“highest confidence”（0.900）。將PPI網絡導入Cytoscape3.8.0軟件進行網絡拓撲學分析，設置參數以節點大小和顏色深淺反映其度值大小，以邊的粗細反映結合率評分高低。

1.6 GO和KEGG通路富集分析

采用R clusterProfiler 3.16.1軟件對關鍵靶點進行GO和KEGG通路富集分析。GO富集分析包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組分（cellular component，CC）三部分，保留校正后的值（.adjust）＜0.01的結果；通過KEGG通路富集分析以確定關鍵靶點的作用通路，保留.adjust＜0.01的結果。

1.7 分子對接驗證

將所有核心成分與核心靶點進行分子對接，并用臨床治療IPAH的靶向藥物依前列醇、西地那非和波生坦進行對照。首先通過PubChem數據庫獲得各核心成分的SDF文件，依次導入殷賦云計算平臺（https://cloud.yinfotek.com/console/）的“小工具-準備化合物結構”進行加氫、加電荷和MMFF94力場下能量優化。利用AutoDockTools1.5.6軟件依次檢測可旋轉鍵的數目，納入可旋轉鍵數＜10的核心成分進行對接。對于核心靶點，首先利用RCSB PDB數據庫（http://www.rcsb.org/pdb）依次獲得PDB文件，蛋白種屬設置為“Homo sapiens”，實驗方法選擇X射線衍射，篩選綜合分辨率、得分最高的蛋白結構，并導入殷賦云計算平臺的“小工具-處理PDB結構”對蛋白質進行隱藏溶劑、去水和去配體。經AutoDockTools1.5.6軟件處理后，將核心成分和核心靶點導入AutoDock4.2.6進行分子對接，采用拉馬克遺傳算法對二者的最佳結合位點進行預測，設置初始種群數為150、能量評定最大次數為2500 000、對接的構象數目為50個，其他參數選擇默認值。以結合能作為評價指標，使用PyMOL2.4軟件對構象進行可視化及氫鍵繪制。靶向藥物的處理流程同上。

1.8 核心靶點的微陣列芯片驗證

為檢驗核心靶點可靠性，以“idiopathic pulmonary arterial hypertension”為關鍵詞，檢索美國國立生物技術信息中心（NCBI）的GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），篩選IPAH相關的微陣列芯片數據集。數據采用Robust-Multi-Array（RMA）方法進行背景矯正和log標準化處理。使用R PCAtools 2.5.15進行主成分分析并進行可視化，檢查樣本聚類的一致性。然后利用GEO2R在線平臺（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）篩選IPAH樣本的差異表達基因（DEGs），篩選閾值為.adjust＜0.05和|log2FC|＞1，利用R EnhanceVolcano 1.6.0繪制火山圖。最后將DEGs與核心靶點取交集，驗證上述分析的準確性。

1.9 xCell評分估計和相關性分析

使用R xCell 1.1.0進行評分，估計數據集中IPAH組與對照組之間64種免疫細胞和基質細胞類型的豐度。使用R ggplot23.3.5和R ggpubr 0.4.0繪制箱線圖，以可視化2組之間所有細胞類型豐度的差異。采用克魯斯卡爾-沃利斯檢驗（Kruskal-Wallis test）進行顯著性檢驗，＜0.05表示差異有統計學意義，再根據Travaglini等人類肺部細胞圖譜篩選差異細胞類型。然后使用R ggstatsplot 0.9.0對核心靶點和差異細胞類型進行Spearman相關性分析并進行顯著性檢驗，＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 天龍咳喘靈活性成分

通過TCMSP數據庫檢索并篩選得到除青天葵外天龍咳喘靈的活性成分，分別為半夏13個、款冬花22個、附子21個、魚腥草7個、北五味子8個、黃芩36個、芥子3個、細辛8個和麻黃23個。通過HERB數據庫獲得青天葵活性成分33個。兩者合并、去重后得到160個活性成分，部分活性成分基本信息見表1。

表1 天龍咳喘靈部分活性成分基本信息

2.2 藥物-成分-疾病-靶點網絡

160個活性成分通過HERB、SwissTargetPrediction數據庫查找到潛在關聯靶點957個，通過GeneCards、DisGeNET數據庫檢索出IPAH相關靶點86個，將藥物活性成分靶點與疾病靶點取交集，獲得38個共同靶點，即天龍咳喘靈抗IPAH的關鍵靶點，維恩圖見圖1。利用Cytoscape3.8.0軟件構建藥物-成分-疾病-靶點網絡，見圖2。

圖1 天龍咳喘靈活性成分、天龍咳喘靈與IPAH共同靶點維恩圖

圖2 天龍咳喘靈抗IPAH藥物-成分-疾病-靶點網絡

該網絡由121個節點（1個疾病名、1個藥物名、10個藥味名、71個活性成分和38個關鍵靶點）和294條邊組成。將109個節點和214條邊（除去疾病名、藥物名、藥味名和相連成分的邊）納入網絡拓撲學分析。所有活性成分平均度值為4.07，高于均值的活性成分有9個，將其作為天龍咳喘靈抗IPAH的核心成分；所有靶點平均度值為3.93，高于均值的靶點有13個。核心成分及篩選后的靶點見表2。

表2 天龍咳喘靈抗IPAH藥物-成分-疾病-靶點網絡拓撲學分析

2.3 蛋白相互作用網絡和核心靶點

將38個關鍵靶點導入STRING數據庫構建PPI網絡，見圖3。該網絡包括32個節點和75條邊（其中6個靶點不連接其他蛋白，故不顯示）。經Cytoscape3.8.0軟件網絡拓撲學分析，各節點的平均度值為4.69，平均介數為0.05，平均接近中心性為0.46，平均最短路徑長度為2.34。度值、介數、接近中心性均高于均值且平均最短路徑長度低于均值的靶點共有3個，見表3。綜合表2、表3，PTGS2、NOS2、ADRB2和VEGFA可能是天龍咳喘靈抗IPAH的核心靶點。

圖3 天龍咳喘靈抗IPAH關鍵靶點PPI網絡

表3 天龍咳喘靈抗IPAH PPI網絡關鍵靶點基本信息

2.4 GO富集分析

38個關鍵靶點GO富集分析得到958個顯著富集條目（.adjust＜0.01），其中BP條目925個，涉及循環系統中的血管過程、管徑調節、血管直徑調節等；CC條目11個，涉及膜筏、膜微區、小窩等；MF條目22個，涉及細胞因子活性、受體配體活性、細胞因子受體結合等。根據.adjust值從小到大選取前10位BP、MF、CC條目繪制氣泡圖，見圖4。

圖4 天龍咳喘靈抗IPAH關鍵靶點GO功能富集分析

2.5 KEGG通路富集分析

38個關鍵靶點顯著富集在48條通路上（.adjust＜0.01）。根據.adjust值從小到大選取前10條通路，見圖5。主要通路有糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路、血流剪切應力與動脈粥樣硬化、HIF-1信號通路、TNF信號通路和鈣信號通路等，提示天龍咳喘靈通過作用于多條通路發揮治療IPAH的作用。

圖5 天龍咳喘靈抗IPAH關鍵靶點KEGG通路富集分析

2.6 分子對接驗證

核心成分、靶向藥物與核心靶點分子對接結果見表4。一般認為，受體蛋白與配體結合能≤0 kcal/mol提示二者存在自發結合，結合能≤-5 kcal/mol時可能具有較好的結合活性。分子對接結果顯示，核心成分與核心靶點幾乎均可自發結合，其中PTGS2與槲皮素、木犀草素、2"-脫氧胸苷、熊果酸、山柰酚、漢黃芩素和隱品堿的結合能均小于-5 kcal/mol；NOS2與木犀草素、熊果酸、山柰酚、漢黃芩素和隱品堿的結合能均小于-5 kcal/mol；ADRB2與槲皮素、木犀草素、熊果酸和隱品堿的結合能均小于-5 kcal/mol；VEGFA與熊果酸和隱品堿的結合能均小于-5 kcal/mol。熊果酸與各核心靶點的平均結合能最小，表明熊果酸與核心靶點的結合活性最好，且優于依前列醇、西地那非和波生坦的結合活性。分子對接模式見圖6，顯示熊果酸與核心靶點受體蛋白周圍分子通過氫鍵等范德華力形成較為穩定的構象。

表4 天龍咳喘靈抗IPAH核心成分、靶向藥物與核心靶點分子對接結果

圖6 熊果酸與核心靶點分子對接模式

2.7 核心靶點微陣列芯片驗證結果

最終選定微陣列芯片數據集GSE130391。該數據集基于GPL570 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0陣列平臺，包含4例IPAH患者和4名健康人肺動脈的RNA樣本，主成分分析結果見圖7，4例IPAH患者與4名健康人的基因表達譜區分度良好，可保證后續差異表達分析的準確性。最終篩選得到DEGs共2469個，其中表達上調1361個、下調1108個，組間差異火山圖見圖8。DEGs與核心靶點取交集后得到2個交集基因，分別為PTGS2和VEGFA，表明上述分析可靠。

圖7 IPAH數據集樣本主成分分析

圖8 IPAH數據集樣本DEGs火山圖

2.8 xCell評分估計結果

IPAH組與對照組之間64種免疫細胞和基質細胞類型的豐度差異見圖9。組間共有27種細胞類型差異有統計學意義（＜0.05），再根據人類肺部細胞圖譜進一步篩選差異細胞類型，保留上皮細胞（Epithelial cells）、CD8陽性T細胞（CD8+T cells）、B細胞（B cells）、樹突狀細胞（DC）、內皮細胞（Endothelial cells）、CD8陽性幼稚T細胞（CD8+naive T cells）、CD4陽性幼稚T細胞（CD4+naive T cells）、CD4陽性效應記憶型T細胞（CD4+Tem）、漿細胞（Plasma cells）、自然殺傷T細胞（NKT）、周細胞（Pericytes）和M1型巨噬細胞（Macrophages M1）12種細胞類型作為最終的差異細胞類型。

圖9 IPAH數據集樣本64種細胞類型豐度箱線圖

2.9 核心靶點與差異細胞類型相關性分析

相關性分析結果表明，PTGS2與自然殺傷T細胞（=0.74，=0.037）、樹突狀細胞（=0.74，=0.037）、上皮細胞（=0.74，=0.037）、周細胞（=0.71，=0.047）呈正相關，與CD4陽性效應記憶型T細胞（=-0.85，=0.007）、B細胞（=-0.79，=0.027）、CD8陽性T細胞（=-0.57，=0.037）、CD4陽性幼稚T細胞（=-0.74，=0.037）呈負相關。VEGFA與B細胞（=-0.86，=0.007）和CD4陽性效應記憶型T細胞（=-0.80，=0.017）呈負相關，而ADRB2、NOS2與所有差異細胞類型無相關性。

3 討論

天龍咳喘靈針對肺系疾病病機特點，以“溫腎化痰活血”為核心理念，治療IPAH患者氣虛不固、血行不暢、濕邪阻滯等病證，對改善血管功能障礙、血栓形成等病理表現具有潛在功效。由于天龍咳喘靈多成分、多靶點、多通路的作用特點，需借助高通量測序技術、計算機輔助技術、藥物相關數據庫等多學科交叉的基礎上對藥物的作用機制進行多維度探索。因此，本研究基于整合藥理學和轉錄組學的方法對天龍咳喘靈抗IPAH進行可行性分析并探討其作用機制。

通過網絡藥理學和分子對接發現，天龍咳喘靈中抗IPAH相關的核心成分共9個，其中與核心靶點結合活性最好且優于對照藥物的是熊果酸。熊果酸存在于青天葵中，具有抗炎、抗腫瘤血管生成、抗氧化及降血壓等多種藥理作用。同時，熊果酸可改善阿霉素處理小鼠的左心室縮短率和左心室射血分數，提高NO水平，抑制活性氧生成，減少心肌細胞凋亡。此外，熊果酸還可以通過調節過氧化物酶體增殖物激活受體α依賴的脂肪酸代謝抑制野百合堿處理大鼠的右心功能障礙與重構、心肌肥大、纖維化和心肌細胞凋亡。NO缺乏與右心衰竭均為IPAH的病理特征，表明熊果酸具有抗IPAH潛在功效。除熊果酸外，青天葵中的2"-脫氧胸苷和L-色氨酸作為核心成分均可與核心靶點穩定結合。而青天葵作為天龍咳喘靈的君藥，高度提示天龍咳喘靈抗IPAH存在較大的可行性。

通過藥物-成分-疾病-靶點網絡和PPI網絡分析，從38個疾病靶點中篩選出4個核心靶點PTGS2、NOS2、ADRB2和VEGFA。PTGS2可將花生四烯酸代謝成特定的前列腺素（PG）產物，研究表明該基因在病理條件下起到雙刃劍作用，一方面刺激促炎細胞因子產生而加重炎癥反應，另一方面促進具有心血管保護作用的前列環素產生，或增加肺血管內皮細胞中PGE2的合成以維持血管微環境穩態，甚至純合敲除PTGS2小鼠在慢性缺氧條件下產生更嚴重的肺動脈高壓（PAH），提示該基因在PAH的發生發展中起到關鍵作用。NOS2通過半胱氨酸蛋白酶-1激活后可以產生大量NO，而過量的NO會引起氧化應激，最終導致肺動脈和右心重塑。ADRB2編碼β腎上腺素能受體，研究表明其信號轉導作用在PAH中呈現階段性變化：活化的β腎上腺素能受體在病程早期對右心室具有保護作用，并可能通過促進M2型巨噬細胞的募集改善肺血管重構，對PAH的治療具有潛在益處。而在病程晚期則可能激活β-AR-G-PKA/CaMKⅡ信號通路而促進右心重塑和心肌細胞凋亡增加，最終導致右心衰竭。VEGFA是血管內皮生長因子家族的成員，能夠促進血管內皮細胞增殖和血管生成，通過PI3K/AKT信號通路抑制血管內皮細胞凋亡，維持內皮細胞的活性，有助于肺部受損微血管再生和防止現有血管丟失，延緩PAH的發生發展。

鑒于核心靶點與IPAH關聯的研究較少，因此借助xCell評估和相關性分析發現，PTGS2與自然殺傷T細胞、樹突狀細胞、上皮細胞和周細胞呈顯著正相關，與CD4陽性效應記憶型T細胞、B細胞、CD8陽性T細胞和CD4陽性幼稚T細胞呈負相關，VEGFA與B細胞和CD4陽性效應記憶型T細胞呈顯著負相關。研究表明CD4陽性效應記憶型T細胞、CD8陽性T細胞、CD4陽性幼稚T細胞、B細胞和樹突狀細胞在IPAH的病程進展中起重要作用；IPAH患者體內免疫紊亂，存在自身免疫病理損傷，可能是自然殺傷T細胞缺乏的主要因素；PAH患者周細胞功能缺陷可導致肺血管再生障礙。因此，我們推測PTGS2通過升高自然殺傷T細胞、樹突狀細胞和周細胞，或減少CD4陽性效應記憶型T細胞、CD8陽性T細胞、CD4陽性幼稚T細胞、B細胞，VEGFA通過減少B細胞和CD4陽性效應記憶型T細胞參與IPAH的發生發展。以上假設還需進一步研究來闡明核心靶點和免疫細胞及其他細胞類型之間復雜的相互作用。

GO富集分析表明，天龍咳喘靈抗IPAH可能通過調節血管的多種生理功能、能量代謝過程，涉及神經遞質、血紅素、不同細胞組分的蛋白質等多種物質發揮療效。KEGG通路富集分析表明，天龍咳喘靈抗IPAH可能主要涉及糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路、血流剪切應力與動脈粥樣硬化、HIF-1信號通路、鈣信號通路等。血流剪切應力是內皮細胞穩態的關鍵因素，當內皮細胞穩態失衡會導致叢狀病變、慢性炎癥細胞浸潤和肺動脈原位血栓形成等IPAH特征性病理改變，因此可以通過調節血流剪切應力來改善內皮細胞功能障礙。缺氧誘導因子（HIF）-1α是應答缺氧應激的關鍵蛋白，有研究表明，在人肺動脈平滑肌細胞中使用siRNA敲除HIF-1α可以增加miRNA-543的表達，從而上調內皮素-1（ET-1）的表達。ET-1通過細胞膜上的ET-1受體直接作用于人PASMCs，增加肺動脈血管張力。另外，在IPAH患者的上皮細胞中HIF-1α顯著表達，刺激血管和紅細胞的生成。PASMCs胞漿內游離Ca濃度的增加也是促使血管收縮和刺激肺動脈平滑肌肥厚的重要因素，已有研究證實，急性血管反應試驗陽性的IPAH患者受益于鈣通道阻滯劑，因此調節鈣信號通路對治療IPAH具有重要意義。可以看出，天龍咳喘靈可能通過IPAH的關鍵信號通路來發揮治療作用。

綜上所述，本研究通過整合藥理學和轉錄組學預測了天龍咳喘靈抗IPAH的核心成分及核心靶點的潛在作用機制，提示天龍咳喘靈可能通過熊果酸等活性成分靶向PTGS2、NOS2、ADRB2和VEGFA基因，調節B細胞、樹突狀細胞、CD8陽性T細胞、CD4陽性幼稚T細胞等細胞類型，調控血流剪切應力與動脈粥樣硬化、HIF-1信號通路、鈣信號通路等多條通路發揮治療作用，可為后續天龍咳喘靈抗IPAH的藥理學研究和臨床試驗提供理論依據和豐富線索。