環境相關濃度的卡馬西平對斑馬魚幼魚抗氧化系統和神經遞質系統的影響

楊慧婷，谷孝鴻，陳輝輝，曾慶飛，毛志剛，李紅敏，葛優，查金苗

1.中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環境國家重點實驗室，南京 210008

2.中國科學院大學，北京 100049

3.中國科學院生態環境研究中心 環境水質學國家重點實驗室,北京 100085

近年來，隨著藥物在農業、水產養殖業和人類醫療中大量頻繁地使用[1-2]，自然水體中藥物污染物對非目標水生生物的生態風險引起社會各界的廣泛關注。卡馬西平(carbamazepine,CBZ)是臨床上治療癲癇、雙向情感障礙和三叉神經痛的常用藥物[3]，在我國的年消費量可達78 t[4]。由于CBZ的大量使用，且在大多數污水處理廠中的去除率較低(<10%)[5-6]，CBZ在地表水中廣泛被檢出。目前，CBZ在地表水和污水中的濃度水平為ng·L-1～μg·L-1[7-10]，我國長江三角洲地區的蘇州河中CBZ的濃度高達1.09 μg·L-1[8]，而在希臘圣托里尼島的Kamari污水處理廠入水中CBZ的濃度高達6.82 μg·L-1[9]。此外，CBZ在水環境中的半衰期較長((82±11) d)[11-12]，且能夠持續不斷地進入水體環境中，具有環境持久性。

迄今為止，已有多篇文獻報道了CBZ能夠對非目標水生生物產生不良影響。例如，在0.03～30 μg·L-1CBZ中暴露21 d后，同形溞(Daphniasimilis)的蛻皮受到顯著抑制，生殖力顯著降低[13]。中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)在1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ中暴露40 d后，其蛻皮和生長受到顯著抑制[14]。河蜆(Corbiculafluminea)在0.5～50 μg·L-1CBZ中暴露30 d后，其鰓和消化腺內產生氧化應激效應，虹吸行為減弱[6]。斑馬魚(Daniorerio)胚胎(受精后4 h)暴露在1～5 μg·L-1CBZ中92 h后，其生長發育顯著加速[15]。斑馬魚成魚在10 μg·L-1CBZ中暴露63 d后，其攝食行為顯著減慢、受精卵的成活率顯著降低，頭部的乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)活性顯著升高，肝臟和腮內產生氧化應激效應[16]。此外，CBZ對魚類具有類雌激素效應，能夠干擾魚類的內分泌系統[11]，然而目前有關環境相關濃度下的CBZ對魚類的慢性毒性效應十分有限，尤其是發育階段的魚類。

本研究選擇斑馬魚幼魚為受試生物，研究環境相關濃度下CBZ的慢性暴露對魚類抗氧化系統和神經遞質系統的影響。將斑馬魚幼魚(～2月齡)暴露在2種環境相關濃度的CBZ(1 μg·L-1和10 μg·L-1)中28 d，首先對斑馬魚幼魚的體長和體質量進行測定，評估CBZ對斑馬魚幼魚生長發育的影響，其次對斑馬魚幼魚腦組織和肝臟中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、過氧化氫酶(catalase,CAT)活性和丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)濃度進行測定，評估CBZ對斑馬魚幼魚抗氧化系統的影響，最后對斑馬魚幼魚腦組織中的AChE活性、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)濃度和谷氨酸(glutamate,Glu)濃度進行測定，評估CBZ對斑馬魚幼魚神經遞質系統的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物

斑馬魚幼魚(野生AB型，～2月齡)購自費曦生物(上海，中國)，并馴養在實驗室養殖系統內。養殖系統的光/暗周期設置為14 h∶10 h，養殖用水的溫度為(28±1) ℃，pH為7.2±0.1，電導率為(500±50) μS·cm-1，每天定時投喂魚飼料和剛孵化的豐年蝦(Artemianaupli)各一次。暴露實驗開始前1 d停止喂食。

1.2 實驗材料及儀器

所用試劑：CBZ(CAS號：298-46-4，純度>97%，梯希愛，日本)、二甲亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO；CAS號：67-68-5，純度>99%，Sigma，美國)、磷酸緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS；碧云天，中國)、總蛋白測定試劑盒(南京建成，中國)、SOD測定試劑盒(南京建成，中國)、CAT測定試劑盒(南京建成，中國)、MDA測定試劑盒(南京建成，中國)、AChE測定試劑盒(酶免，中國)、GABA測定試劑盒(酶免，中國)和Glu測定試劑盒(酶免，中國)。

所用儀器：金屬浴(SCILOGEX HC 110-PRO，SCILOGEX，美國)、勻漿儀(OSE-Y30，TIANGEN，中國)、漩渦混勻儀(SCILOGEX MX-S，SCILOGEX，美國)、離心機(Eppendorf 5804R，Eppendorf，德國)、恒溫培養箱(JYC-412，HENGZWELL，中國)、酶標儀(BioTek Synergy HTX，BioTek，美國)和超高效液相色譜質譜聯用儀(ACQUITY H-class UPLC，Xevo TQD，Waters，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 暴露液配制

將0.2 g CBZ溶解到0.01 L DMSO中制備20 g·L-1的CBZ母液，隨后將CBZ母液進行梯度稀釋配制成0.02 g·L-1和0.2 g·L-1的CBZ儲備液，最后將0.02 g·L-1和0.2 g·L-1CBZ儲備液分別用養殖水稀釋得到1 μg·L-1和10 μg·L-1的CBZ暴露液。實驗以0.005% DMSO(1∶20 000，V/V)為溶劑對照組。

1.3.2 斑馬魚暴露

實驗室馴化2周后，隨機選取180條斑馬魚幼魚(體長為(2.93±0.16) cm，體質量為(0.25±0.14) g)進行暴露實驗。暴露容器為3 L燒杯，分別設置對照組(0.005% DMSO)和2個處理組(1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ)，每個組設置3個平行，每個平行隨機放入20條斑馬魚幼魚于3 L實驗溶液中。采用半靜態暴露方法，暴露周期為28 d，每天更換50%實驗溶液，光照條件、溫度和投喂方法等其他條件同馴化條件一致。暴露實驗結束后，將幼魚放置在冰水中進行麻醉，測量幼魚的體長和體質量。在每個平行中隨機選取4～5只幼魚，分別解剖出腦組織和肝臟混合作為一個樣品放置在1.5 mL離心管里，置于液氮快速冷凍后轉移到-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.3 暴露液濃度測定

暴露液測定方法參考本課題組之前的研究[6,14]。暴露實驗結束后，從每個組中取1.5 mL暴露液，暴露液通過0.22 μm針筒式過濾器過濾后置于2 mL棕色玻璃瓶中收集。收集后的暴露液用超高效液相色譜質譜聯用儀檢測。每個組測定的暴露液樣品共3個(n=3)。色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters，美國)溫度為40 ℃，流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，進樣量為5 μL，流速為0.4 mL·min-1。藥品洗脫程序：0.5 min，5% B；0.5～6 min，5% B升至70% B；6.0～7.0 min，70% B升至95% B，7.1 min降至5% B。質譜條件：離子源為電噴霧電離源正離子模式，檢測方式為多離子反應監測，離子源溫度為150 ℃，毛細管電壓為2.0 kV，脫溶劑溫度為450 ℃，錐孔氣流量為50 L·h-1。采用外標法測定暴露液中的CBZ濃度，準確配制濃度為0.5、1、5、10、50、100和150 μg·L-1的標準溶液，繪制標準曲線。方法檢出限和定量限分別為0.01 ng·L-1和0.02 ng·L-1。每個組檢測到的暴露液濃度如表1所示(本文全篇使用CBZ的名義濃度)。

表1 卡馬西平(CBZ)暴露液實際濃度Table 1 The carbamazepine (CBZ) concentration measured in the exposure solutions

1.3.4 抗氧化系統及神經遞質系統相關物質測定

準確稱量幼魚的腦組織或肝臟并放置在新的1.5 mL離心管中，按照質量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例，將1×PBS添加到不同的幼魚樣品(腦組織樣品和肝臟樣品)中，隨后將樣品放置在金屬浴(-2 ℃～2 ℃)中進行勻漿，最后將勻漿后的樣品進行離心(4 ℃，2 500 r·min-1條件下離心10 min)，取上清液備用(根據所測定的物質對上清液稀釋不同的倍數)。每個組測定的腦組織和肝臟樣品共3個(n=3)。根據不同的試劑盒說明書測定幼魚體內的總蛋白濃度、SOD活性、CAT活性、MDA濃度、AChE活性、GABA濃度和Glu濃度。

1.4 數據分析

使用GraphPad Prism 6.0軟件進行實驗數據的分析和制圖。采用Kolmogorov-Smirnov和Levene分別檢驗實驗數據的正態性和方差齊性。處理組和對照組之間的顯著性檢驗采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Holm-Sidak多重比較檢驗。實驗數據均以平均值±標準誤差(mean±SEM)表示。處理組和對照組之間的顯著性水平為P<0.05。

2 結果(Results)

2.1 CBZ對斑馬魚生長發育的影響

在暴露28 d后，測定了斑馬魚幼魚的體長和體質量(圖1)。結果顯示，與對照組相比，1 μg·L-1CBZ處理組中的幼魚體長未出現顯著性變化(圖1(a))，10 μg·L-1CBZ處理組中的幼魚體長顯著增加(P=0.0257) (圖1(a))，1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ處理組中的幼魚體質量未出現顯著性變化(圖1(b))，表明10 μg·L-1CBZ的慢性暴露能夠促進斑馬魚幼魚的生長發育。

2.2 CBZ對斑馬魚抗氧化系統的影響

在暴露28 d后，測定了斑馬魚幼魚腦組織和肝臟中的SOD活性、CAT活性和MDA濃度(圖2)。結果顯示，與對照組相比，1 μg·L-1CBZ暴露下，幼魚腦內的SOD活性(P=0.0129)和CAT活性(P=0.0301)顯著增加(圖2(a)和(b))，肝臟中的SOD活性(P=0.0365)顯著降低，CAT活性(P=0.0026)和MDA濃度(P=0.0009)顯著增加(圖2(d)、(e)和(f))。與對照組相比，10 μg·L-1CBZ暴露下，幼魚腦內的SOD活性(P=0.0187)顯著增加(圖2(a))，肝臟中的CAT活性(P=0.0184)和MDA濃度(P=0.0004)顯著增加(圖2(e)和(f))。實驗結果表明，1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ的慢性暴露能夠干擾斑馬魚幼魚腦組織和肝臟中的抗氧化系統，誘導幼魚腦組織和肝臟產生氧化應激效應。

圖2 CBZ暴露對斑馬魚幼魚腦組織和肝臟中抗氧化系統的影響注：斑馬魚幼魚暴露在對照組(Control)、1、10 μg·L-1 CBZ中28 d；SOD表示超氧化物歧化酶，CAT表示過氧化氫酶，MDA表示丙二醛；數據以平均值±標準誤差表示，星號表示處理組與對照組之間有顯著性差異(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。Fig.2 Effects of CBZ exposure on the antioxidation system in the brain and liver of juvenile zebrafishNote:Juvenile zebrafish exposed to Control,1,10 μg·L-1 CBZ for 28 d;SOD stands for superoxide dismutase,CAT stands for catalase,and MDA stands for malonic dialdehyde;the data are expressed as mean±SEM,and asterisk denote significant differences (*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001) between treatments and controls.

2.3 CBZ對斑馬魚神經遞質系統的影響

在暴露28 d后，測定了斑馬魚幼魚腦組織中的AChE活性、GABA濃度和Glu濃度(圖3)。結果顯示，與對照組相比，10 μg·L-1CBZ暴露能夠顯著抑制幼魚腦組織中的AChE活性(P=0.033) (圖3(a))，1 μg·L-1(P=0.0001)和10 μg·L-1(P=0.0001)CBZ暴露能夠顯著提高幼魚腦組織中的GABA濃度(圖3(b))，而幼魚腦組織中的Glu濃度在1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ暴露后未出現顯著性變化(圖3(c))。實驗結果表明，1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ的慢性暴露能夠干擾斑馬魚幼魚腦組織中的神經遞質系統，產生神經毒性。

圖3 CBZ暴露對斑馬魚幼魚腦組織中神經遞質系統的影響注：斑馬魚幼魚暴露在對照組(Control)、1、10 μg·L-1 CBZ中28 d；AChE表示乙酰膽堿酯酶，GABA表示γ-氨基丁酸，Glu表示谷氨酸；數據以平均值±標準誤差表示，星號表示處理組與對照組之間有顯著性差異(*P<0.05,***P<0.001)。Fig.3 Effects of CBZ exposure on the neurotransmitter systems in the brain of juvenile zebrafishNote:Juvenile zebrafish exposed to Control,1,10 μg·L-1 CBZ for 28 d;AChE stands for acetylcholinesterase,GABA stands for γ-aminobutyric acid,and Glu stands for glutamate;the data are expressed as mean±SEM,and asterisk denote significant differences (*P<0.05,***P<0.001) between treatments and controls.

3 討論(Discussion)

Qiang等[15]報道了1～5 μg·L-1CBZ的急性暴露(92 h)能夠導致斑馬魚仔魚的體長增加、卵黃囊面積減少和魚鰾發育迅速，表明CBZ能夠加速斑馬魚仔魚的生長發育。在本研究中，10 μg·L-1CBZ的慢性暴露能夠導致斑馬魚幼魚的體長顯著增加，表明CBZ促進了幼魚的生長發育。CBZ是對魚類能夠產生類雌激素效應的藥物[11]。性激素能夠促進生物體的食欲和生物體內蛋白質的合成，從而促進生物體的生長[17-18]。因此，10 μg·L-1CBZ處理組中斑馬魚幼魚體長的增加可能與CBZ的類雌激素效應有關。作為一種精神類藥物，CBZ能夠提高細胞外的血清素(serotonin,5-HT)濃度，增強5-HT能系統的神經傳遞[19]。5-HT在調節魚類發育方面發揮著重要作用[20-22]。例如，Barreiro-Iglesias等[20]報道了5-HT能夠促進斑馬魚脊髓運動神經元的發育和再生。Bashammakh等[21]研究發現5-HT在斑馬魚的咽弓形態形成過程中發揮著重要作用。Airhart等[22]報道了5-HT水平的減少能夠對斑馬魚早期發育階段的體長和脊索形態等造成不良影響。因此，10 μg·L-1CBZ處理組中斑馬魚幼魚體長的增加可能與其體內5-HT能系統神經傳遞的異常有關。由于物種生長發育的加速可能會對其產生不利的影響，因此今后還需要進一步的研究CBZ加速斑馬魚生長發育的具體機制。

在正常的生理條件下，生物體內活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生和清除處于一種動態平衡狀態，而一旦這種平衡被打破(ROS過量生成)，就會導致氧化應激[23-24]。生物體抗氧化系統中的抗氧化酶和抗氧化劑在清除ROS方面具有重要作用[25]，而抗氧化酶活性和抗氧化劑含量的改變能夠誘導氧化損傷[26]。其中，SOD和CAT在生物體抗氧化系統防御氧化應激過程中發揮著重要作用，前者負責將細胞內氧自由基(O2-)轉化為過氧化氫(H2O2)和分子氧(O2)，后者隨后將H2O2轉化為水(H2O)和O2[23-24]。SOD和CAT活性的增加表明這2種酶能夠清除機體產生的過量ROS，而SOD和CAT的活性降低表明機體的蛋白質結構受到了損傷[24,27-28]。脂質過氧化是ROS在機體內引起的最常見的細胞損傷，被認為是氧化應激的主要生物指標之一[23,25-26]。當生物體內的ROS含量超過抗氧化酶的清除能力時，過量的ROS就會刺激MDA的產生[6,29]。MDA是生物體內O2-與多不飽和脂肪酸發生過氧化反應后形成的脂質過氧化產物，其濃度水平可作為機體脂質過氧化的指標[23,25-26]。

在本研究中，斑馬魚幼魚腦內的SOD活性在1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ暴露下均顯著增加，CAT活性僅在1 μg·L-1CBZ暴露下顯著增加，但是2種濃度的CBZ暴露均未引起斑馬魚幼魚腦組織中MDA水平出現顯著性變化，表明2種CBZ濃度暴露下的斑馬魚幼魚腦組織受到了輕微的氧化損傷，而幼魚腦組織中的抗氧化系統能夠通過提高抗氧化酶的活性減弱氧化損傷。另外，斑馬魚幼魚肝臟中的SOD活性僅在1 μg·L-1CBZ暴露下顯著降低，幼魚肝臟中CAT活性和MDA含量在1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ暴露下均顯著增加，表明2種CBZ濃度暴露下的斑馬魚幼魚肝臟均受到了嚴重的氧化損傷。肝臟是生物體排毒的主要器官，具有高度的代謝活性[30-31]，可能比其他組織暴露在更高水平的藥品中，因此斑馬魚的肝臟受到的氧化損傷相比于腦組織更加嚴重。根據已有報道，生物體內抗氧化防御系統的激活與化合物誘導的神經毒性的降低有關[32-33]。因此，本研究中1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ處理組對斑馬魚腦組織和肝臟引起的氧化損傷可能與2種濃度的CBZ誘導的神經毒性效應有關，這需要進一步的研究。由于斑馬魚幼魚的肝臟受到了嚴重的氧化應激，引起ROS在肝臟中積累，可能對蛋白質、核酸和脂質等生物大分子造成損傷，從而影響斑馬魚幼魚肝臟的正常生理功能[25,34]。此外，已有相關文獻也報道了環境相關濃度的CBZ對斑馬魚的氧化應激效應[16,32]。例如，da Silva Santos等[16]發現10 μg·L-1CBZ的慢性暴露(63 d)能夠引起斑馬魚成魚腮、腸道和肝臟中的抗氧化酶(CAT和谷胱甘肽S-轉移酶)活性顯著改變[16]。不僅如此，CBZ也能夠引起其他的水生生物產生氧化應激效應[6,35]。例如，Chen等[6]報道了0.5～50 μg·L-1CBZ的慢性暴露(30 d)能夠引起河蜆(Corbiculafluminea)腮和消化腺中的抗氧化酶(SOD、CAT和谷胱甘肽還原酶)活性和氧化產物(MDA)濃度改變。此外，本研究中10 μg·L-1CBZ的慢性暴露(28 d)能夠顯著誘導斑馬魚幼魚肝臟內的CAT活性，但da Silva Santos等[16]發現10 μg·L-1CBZ的慢性暴露(63 d)能夠顯著抑制斑馬魚成魚肝臟內的CAT活性，筆者推測這可能與較長時間的CBZ暴露導致斑馬魚肝臟內氧化損傷(ROS產生過量所致)的加重有關，CAT受到損傷(活性降低)無法發揮正常的作用。綜上所述，本研究結果表明，1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ的慢性暴露均導致斑馬魚幼魚的腦組織和肝臟產生了氧化應激，但是斑馬魚幼魚的肝臟產生的氧化應激效應相比于腦組織更為嚴重，可能會對斑馬魚幼魚產生一些不利的影響。

AChE能夠降解突觸間隙中的神經遞質乙酰膽堿，在生物體內神經信號傳遞過程中發揮著重要作用，被廣泛用作神經毒性檢測的生化標記物[36-37]。在本研究中10 μg·L-1CBZ的慢性暴露能夠顯著抑制斑馬魚幼魚腦內的AChE活性，表明10 μg·L-1CBZ能夠干擾幼魚腦內的膽堿能系統，產生神經毒性效應。另外，已有相關文獻也報道了環境相關濃度的CBZ暴露(急性暴露)對水生生物體內AChE活性的抑制作用[38-39]。例如Juhel等[39]發現0.096 μg·L-1CBZ的急性暴露(7 d)能夠顯著抑制貽貝(Pernaviridis)無細胞血淋巴中的AChE活性。然而，da Silva Santos等[16]報道了10 μg·L-1CBZ的慢性暴露(63 d)能夠引起斑馬魚成魚頭部的AChE活性增加。筆者推測da Silva Santos等的結果與本文研究結果不一致的原因可能與不同時長CBZ暴露下對斑馬魚體內膽堿能系統的毒性效應有關，即不同時長的CBZ暴露在斑馬魚體內的毒性作用可能存在差異。例如，Rhee等[40]將朝鮮臂尾輪蟲(Brachionuskoreanus)暴露在100 μg·L-1和1 000 μg·L-1CBZ中12 h和24 h，發現2種濃度的CBZ僅在暴露24 h后對輪蟲體內的AChE活性具有抑制效應。在本研究中，10 μg·L-1CBZ引起斑馬魚幼魚腦內AChE活性降低，可能導致乙酰膽堿在腦內的積累和膽堿能受體的過度刺激[41]。由于乙酰膽堿在調節生物體的運動、學習和記憶等方面發揮著重要作用[41-43]，因此10 μg·L-1CBZ可能對幼魚產生不利的影響。

Glu和GABA分別是脊椎動物中樞神經系統的興奮性神經遞質和抑制性神經遞質，前者能夠介導生物體內興奮性突觸傳遞，后者能夠介導生物體內抑制性突觸傳遞[44-46]。興奮性(Glu)和抑制性(GABA)神經遞質的平衡對生物體運動的調節和生物體內外周信號的整合具有重要作用[45,47]。目前，CBZ的作用機制仍不清楚，可能與電子門控鈉離子通道相互作用，增強GABA的抑制作用，從而引起神經細胞的興奮性降低[48-49]。在本研究中，1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ均引起斑馬魚幼魚腦內的GABA濃度顯著增加，但腦內的Glu濃度未出現顯著性變化，能夠導致幼魚腦內興奮性和抑制性神經傳遞的不平衡，這可能與CBZ的作用機制有關。本研究結果表明，環境相關濃度下CBZ的慢性暴露能夠干擾幼魚腦內的GABA能系統，產生神經毒性。類似地，Chen等[50]發現0.5～50 μg·L-1CBZ的慢性暴露(30 d)能夠干擾河蜆(Corbiculafluminea)體內(外套膜組織、腮、性腺和消化腺)的GABA能系統。由于GABA在調節脊椎動物的生殖[51-52]和運動[45-46]方面發揮著重要作用，因此1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ可能會對斑馬魚幼魚產生不利的影響。

綜上所述，環境相關濃度(1 μg·L-1和10 μg·L-1)CBZ的慢性暴露能夠促進斑馬魚幼魚的生長發育，誘導幼魚的腦組織和肝臟產生氧化應激效應，且肝臟產生的氧化應激效應相比于腦組織更為顯著，同時CBZ暴露能夠干擾幼魚腦組織的膽堿能系統和GABA能系統，產生神經毒性效應。