殼寡糖對鎘致肝臟損傷的保護作用及機理研究

牛舒藝，段心怡，賀佳，謝春艷

湖南農業大學資源環境學院，洞庭湖區農村生態系統健康湖南省重點實驗室，長沙 410128

鎘(cadmium,Cd)是一種毒性大、難降解且污染面積廣的主要環境污染物[1]。近年來，隨著科技的發展和進步，鎘被廣泛應用于冶煉、電池、農藥、化肥等工業和農業領域，致使環境中的鎘含量超出正常范圍，生態系統平衡遭到破壞[2]。鎘可以通過工業制造活動或食品、水、空氣污染以及許多其他潛在來源進入人體[3]，食物一般是鎘暴露的最主要途徑[4]。與其他重金屬相比，殘留于環境中的鎘及其代謝產物由于較強的流動性、持久性和生物累積性[5]，易被作物根系吸收并積累，從而沿食物鏈富集于人類體內并長期蓄積[6-7]，造成多種器官、組織以及細胞和DNA方面的損傷[8]。已有研究證實，鎘可引發動物機體內大腦皮質損傷[9]、心肌細胞凋亡[10]、腎臟淋巴細胞浸潤和肝臟血管炎[11]。此外，鎘能通過參與Fenton反應引起細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平增加，造成動植物細胞氧化損傷[12]。鎘還可誘導細胞內超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)活性下降，肝臟丙二醛(malonaldehyde,MDA)水平增加，細胞自由基代謝失調，導致氧化傷害[13]。

殼寡糖(chitooligosaccharide,COS)又名殼聚寡糖、幾丁寡糖、低聚殼聚糖，其化學名為β-1,4-寡聚-葡萄糖胺，是天然、無毒副作用的低聚糖。COS具有良好的水溶性，有助于提高動物機體免疫力[14]，減少炎癥[15]、各種應激[16-17]帶來的損傷等。相關動物試驗表明，COS可以通過使動物機體內的抗氧化酶活性提升，增強機體對自由基的清除作用，從而降低氧化破壞[18-19]。COS還能對炎癥因子的分泌進行抑制，或促進抗氧化物質的產生，以此減少ROS的產生[20]。COS還是一部分金屬離子的良好配體，且對重金屬離子有較好的吸附效果，可以作為一種吸附劑、配位體或螯合劑[21]。同時，COS處理可以介導核因子紅細胞2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)和核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)抗氧化信號通路，上調其下游抗氧化靶基因的表達，在減輕外源性有害物質誘導的細胞氧化應激中發揮重要作用[22-23]。

NF-κB是細胞內氧化信號通路相關的關鍵轉錄因子[24]。p38 MAPK信號分子則是絲裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)中的一個亞族，主要參與調節細胞的應激、炎癥和凋亡等生物學進程[25]。研究表明，磷酸化的p38 MAPK作用于NF-κB，激活機體的炎癥通路，促進炎癥因子的釋放；炎癥因子反過來促進炎癥信號通路的活化，加劇炎癥反應的發生[26]。有研究顯示，鎘可通過MAPK途徑誘導氧化應激[27]。Nrf2也是氧化應激反應的重要轉錄因子之一[28]。如圖1所示，在重金屬誘導的氧化應激條件下，Nrf2可以結合抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)誘導多種抗氧化酶的表達[29]，在抗炎和減少氧化應激引起的損傷中起著至關重要的作用[30]。既往的研究表明，鎘誘導的肝臟氧化應激常伴隨著Nrf2信號通路的激活[31]，提示該通路在鎘的主要防御機制中有重要意義。

圖1 重金屬誘導的Nrf2信號通路[32]Fig. 1 Heavy metals mediated Nrf2 signaling pathway[32]

綜合以上研究結果可知，鎘可通過p38 MAPK/NF-кB p65/Nrf2介導的信號通路啟動炎癥反應，但具有緩解氧化應激損傷的COS對鎘致肝臟損傷的影響方面的研究還鮮有報道，確切的機制還需要進一步研究探討。本研究采用腹腔注射CdCl2溶液的方式來建立急性鎘暴露小鼠模型，通過在小鼠飲水中添加COS，并對小鼠進行肝臟內ROS水平變化的檢測和病理學觀察，結合血液中抗氧化相關指標的檢測和肝臟氧化應激通路關鍵蛋白p38 MAPK/NF-кB p65/Nrf2表達水平的檢測，研究COS在緩解重金屬致肝臟氧化應激方面的作用和可能機制，對通過添加COS預防或改善鎘累積致動物機體的毒性損傷具有一定的參考價值，有望為COS作為天然生物制劑在重金屬解毒方面的應用提供理論依據和數據支撐，降低部分鎘污染地區動物體和人體的健康風險，達到緩解生態危害的目的。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與試劑

COS為水溶性寡糖，聚合度在2～10之間，以3～4糖為主，分子質量≤2 000，純度為10%，購于中泰和(北京)科技發展有限公司。谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px,GPx)試劑盒、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；MDA試劑盒購于碧云天生物公司，其他試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗動物

選用健康雌性C57BL/6小鼠32只，體質量16～19 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。小鼠飼養環境室內平均氣溫22 ℃，室內照明控制在12 h/12 h光暗周期節律。小鼠的食物為小鼠標準顆粒飼料，自由飲用純凈水及經過COS處理后的純凈水，實驗期為28 d。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與處理

32只雌性小鼠適應飼養4 d后，隨機分為4個處理組，每個處理組8個重復，每個重復1只小鼠，單欄飼養。4個組分別為：空白對照組(Control)、氯化鎘造模組(Cd)、殼寡糖組(COS)、殼寡糖+氯化鎘組(COS+Cd)。空白對照組和氯化鎘造模組小鼠每日飼喂基礎日糧，給予純凈水；殼寡糖組和殼寡糖+氯化鎘組小鼠每日飼喂基礎日糧，在飲水中添加0.3 g·L-1COS。在第28天向氯化鎘造模組和殼寡糖+氯化鎘組小鼠腹腔注射5.45 mg·kg-1氯化鎘(以體質量計)，12 h后眼框取血，置于1.5 mL EP管中，4 ℃下靜置2 h。于3 000 r·min-1、4 ℃離心30 min后，取上清液分裝，在-20 ℃下保存備用。采血后脫頸椎處死，取小鼠肝臟組織在福爾馬林中固定，4 ℃靜置避光保存，每12 h更換固定液。另取一份放入包埋盒，加入適量OCT包埋劑，使組織完全被包埋劑覆蓋，置于液氮中速凍，-80 ℃保存。

1.3.2 肝臟組織病理學檢測

福爾馬林固定好的肝臟組織按常規方法制作石蠟組織切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色，光鏡下觀察肝臟組織結構及肝臟組織病理學變化等。

1.3.3 血清抗氧化相關指標檢測

檢測小鼠血清中GPx活性以及GSH、MDA和GSSG含量，并計算出GSSG/GSH的比值。試驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 肝臟中ROS水平檢測

使用活性氧熒光探針測定，按照說明書建議，以二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解二氫乙錠(dihydroethidium,DHE)配制成溶液，避光放置備用，臨用前將溶液按照1∶1 000的比例稀釋后備用。

將OCT包被好的冷凍組織用冰凍切片機切片。制片后，將稀釋好的探針溶液滴加到組織中。于37 ℃孵育30 min。用PBS洗去多余探針溶液，用抗熒光淬滅劑封片。用熒光顯微鏡觀察并拍照，計算各組的相對熒光強度。

1.3.5 肝臟蛋白水平檢測

Western blot方法檢測肝臟組織中Nrf2、p-NF-кB、NF-кB、p-p38 MAPK、p38 MAPK的蛋白表達水平。剪取適量肝臟組織研磨成干粉狀，倒入EP管中，提取組織總蛋白，然后檢測并將蛋白濃度調至相同，按照說明書進行配制溶液、封閉及孵育等操作，最后使用ECL方法顯色。

1.4 數據處理

應用SPSS 22.0統計軟件對數據進行單因素方差分析(one-way analysis of variance,one-way ANOVA)，比較組間的統計學差異。數據以“平均值±標準差”表示，P<0.05、P<0.01表示差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 飼糧中添加COS對小鼠體質量的影響

由圖2可知，本試驗中氯化鎘急性處理和COS添加均未對小鼠體質量產生顯著影響(P>0.05)。

圖2 各組小鼠體質量注：Control表示空白對照組；Cd表示氯化鎘造模組；COS表示殼寡糖組；COS+Cd表示殼寡糖+氯化鎘組。Fig.2 Body mass of mice in different groupsNote:Control stands for Control group;Cd stands for cadmium chloride model group;COS stands for COS group;COS+Cd stands for COS+cadmium chloride group.

2.2 小鼠肝臟組織病理學觀察

由圖3可知，空白對照組小鼠肝小葉染色均勻，形態結構正常，細胞間有明顯的界限，未見顯著的變性與壞死；殼寡糖組肝臟細胞未產生明顯變化；氯化鎘造模組肝臟組織產生了明顯病理變化，細胞間界限模糊、炎癥和凋亡增多，且細胞核出現萎縮現象(黑色圓圈及箭頭部分)，表明鎘染毒處理對肝臟細胞造成了一定的損傷；殼寡糖+氯化鎘組相對氯化鎘造模組，細胞壞死程度和炎癥減輕，肝臟結構較為清晰。

圖3 光鏡下各組小鼠肝臟細胞形態結構(100倍)注：(a) Control；(b) Cd；(c) COS+Cd；(d) COS；黑色圓圈及箭頭部分表示肝臟細胞核萎縮。Fig.3 Morphology and structure of liver tissue of mice (×100)Note:(a) Control;(b) Cd;(c) COS+Cd;(d) COS;the black circles and arrow indicated liver nuclear atrophy.

2.3 飼糧中添加COS對其血液抗氧化指標的影響

由圖4可知，與氯化鎘造模組相比，通過飲水添加COS顯著降低了小鼠血清中GSH含量和GPx活性(P<0.05)，提高了GSSG含量(P<0.05)，緩解了由于重金屬鎘富集導致的氧化應激，激活了小鼠體內的GSSG/GSH系統(P<0.05)。在正常飼養條件下，飲水中添加COS使小鼠血清中GSH含量呈顯著提升趨勢(P<0.05)，明顯降低了GPx活性和GSSG含量(P<0.05)，使得GSSG/GSH比值大幅升高(P<0.05)。與空白對照組相比，氯化鎘造模組小鼠血清中GSH含量和GSSG/GSH的比值有一定程度的上升(P<0.05)，MDA的含量呈顯著上升趨勢(P<0.01)，而殼寡糖+氯化鎘組的數據顯示，COS顯著抑制了鎘中毒小鼠血清內MDA的產生P<0.05)。

圖4 小鼠血清抗氧化相關指標注：GSH表示谷胱甘肽，GSSG表示氧化型谷胱甘肽，GPx表示谷胱甘肽過氧化物酶，MDA表示丙二醛；不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。Fig.4 Serum antioxidant indexes of miceNote:GSH stands for glutathione;GSSG stands for oxidized glutathione;GPx stands for glutathione peroxidase;MDA stands for malonaldehyde;different letters indicated significant difference (P<0.05),and the same letters indicated no significant difference (P>0.05).

2.4 飼糧中添加COS對肝臟中ROS含量的影響

由圖5可知，與空白對照組相比，氯化鎘造模組小鼠肝臟內代表ROS的紅色熒光強度明顯升高(P<0.01)，添加COS之后，殼寡糖+氯化鎘組紅色熒光強度降低，整體狀態趨近于空白對照組，說明COS可通過減少肝臟中ROS水平，緩解重金屬鎘蓄積而導致的肝臟損傷。

圖5 小鼠肝臟細胞中活性氧(ROS)相對含量注：DAPI表示4’,6-二脒基-2-苯基吲哚，DHE表示二氫乙啶；不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。Fig.5 Relative hepatic reactive oxygen species (ROS) content of miceNote:DAPI stands for 4’,6-diamidino-2-phenylindole,and DHE stands for dihydroethidium;different letters indicated significant difference (P<0.05),and the same letters indicated no significant difference (P>0.05).

2.5 肝臟氧化應激通路關鍵蛋白的相對表達

由圖6可知，重金屬鎘在機體的富集可以有效激活小鼠肝臟內Nrf2(P<0.05)，同時抑制炎癥相關的信號分子磷酸化NF-кB p65的表達(P<0.05)。和空白對照組相比，在小鼠飲水中添加COS后，可顯著抑制Nrf2的表達(P<0.05)，對磷酸化p38 MAPK的表達也有抑制的趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)，對其總蛋白的表達亦無明顯影響(P>0.05)。氯化鎘造模組和殼寡糖+氯化鎘組對比結果顯示，添加COS后小鼠肝臟內Nrf2水平顯著降低(P<0.05)，磷酸化p38 MAPK表達量也有一定程度的降低(P>0.05)。

圖6 小鼠肝臟氧化應激通路相關蛋白表達水平注：NF-κB表示核因子-κB，MAPK表示絲裂原激活蛋白激酶，Nrf2表示核因子紅細胞2相關因子2；不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。Fig.6 Relative expression levels of proteins related to oxidative stress in the liver of miceNote:NF-κB stands for nuclear factor-kappa B,MAPK stands for mitogen activated protein kinase,and Nrf2 stands for nuclear factor erythroid 2-related factor 2;different letters indicated significant difference (P<0.05),and the same letters indicated no significant difference (P>0.05).

3 討論(Discussion)

作為一種重金屬環境污染物，鎘可對細胞產生毒性，導致細胞功能異常，對多種組織和系統造成不可逆的損傷[33-35]。食源性鎘是畜禽鎘暴露的主要來源。動物飼料中的鎘多來自于原料和礦補劑添加，會導致動物體生長緩慢，免疫力下降等，進而影響后期的生長性能及胴體性狀[36]。肝臟是鎘損傷的重要靶器官之一，也是最主要的鎘積累器官[37]。Kuester等[38]研究發現，肝臟在急性或慢性鎘暴露后幾小時內便可以積累大量的鎘。鎘還能導致肝臟出現多種病理性變化，以50 mg·L-1鎘的飲水飼喂大鼠12周，大鼠肝臟MDA含量增加，發生了顯著的脂質過氧化反應[39]。陳夢妍等[40]還發現，急性鎘暴露可導致小鼠肝臟細胞局部出現氣球樣變、炎癥細胞浸潤和壞死等較為明顯的損傷。本試驗采用氯化鎘對小鼠建立急性鎘中毒模型，發現氯化鎘造模組小鼠肝臟中出現肝臟結構不清楚、肝細胞顆粒變性且細胞核萎縮等病理變化，和陳夢妍等[40]的發現基本一致。GSH、GSSG和GPx參與動物體內氧化還原過程，能和過氧化物結合，以對抗氧化劑對臟器細胞的損害。本實驗發現，急性鎘中毒處理可以導致小鼠血清中GSH、MDA的含量和GSSG/GSH比值顯著升高，表明氯化鎘導致小鼠產生了劇烈脂質過氧化反應，并導致機體啟動了相應的抗氧化體系，說明本研究成功建立了小鼠的急性鎘應激模型。

COS具有抗炎[41-42]、抗菌[43]、提高免疫力[44]和改善腸道微生物[45]等作用。許青松等[46]的研究表明，COS還有緩解氧化應激的作用，能抑制肝組織中MDA含量升高，提高肝組織中SOD活性，對四氯化碳造成的小鼠急性肝損傷進行保護。研究表明，COS可增加細胞內CAT活性，提高GSH含量[47]，且對重金屬離子也有一定的吸附效果，可以促進動物機體對鎘的脫除[48]。在本試驗中，與氯化鎘造模組相比，COS添加有助于小鼠肝臟組織損傷的的恢復，減緩炎癥和細胞凋亡，說明COS在保護急性鎘中毒引起的肝臟損傷中具有一定效果。與氯化鎘造模組相比，殼寡糖+氯化鎘組小鼠血清中GSH、MDA的含量和GPx活性顯著降低，GSSG含量顯著提升，動物機體內的GSSG/GSH系統被激活。這顯示COS能夠通過激活動物機體內抗氧化防御系統，來緩解脂質過氧化物的產生而導致肝臟遭受的氧化損害。

鎘能通過參與Fenton反應誘導細胞產生過量ROS，引起細胞內ROS水平增加，造成動物細胞的損傷，其毒性與氧化損傷密切相關[49]。研究表明，COS有清除活性氧自由基或離子的功能[50]。在葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎模型中，COS能抑制活化的中性粒細胞產生過量ROS，從而起到抗炎作用[51]。翟星辰[52]認為，COS可以調控細胞內ROS的積累，達到抑制腎癌對機體損傷的效果。GSH是ROS的天然清除劑，是細胞氧化還原的主要調節因子，可在酶類的催化下氧化生成GSSG[53]。GSH和GSSG之間處于動態平衡，共同緩解機體的氧化應激，二者的氧化還原循環是機體抵抗氧化損傷的重要機制之一，GSSG/GSH比值則是反映機體氧化還原狀態的重要指標[54]。本研究中氯化鎘造模組小鼠肝臟細胞ROS含量急劇上升，而添加COS后小鼠肝臟細胞ROS含量降低，GSSG/GSH比值下降，細胞組織結構有一定的恢復，提示COS可通過調控GSSG/GSH比例減少肝臟ROS產生，具有修復肝臟氧化損傷的功能。

研究表明，鎘可通過增加細胞ROS誘發細胞內氧化還原敏感性轉錄因子的表達，如Nrf2、NF-кB等[55]。氧化應激條件下Nrf2通路被誘導激活，抵抗ROS導致的細胞損傷，是肝臟迄今為止發現的最為重要的內源性抗氧化應激通路[56]，且在降低鎘致毒性方面發揮了重要作用[57]。NF-кB是重要的炎癥相關信號因子，激活后能夠以NF-кB p65的形式存在，在機體的炎性反應和細胞凋亡等過程中發揮著重要作用[58]。本試驗發現，鎘導致小鼠肝臟組織內抗氧化蛋白Nrf2及磷酸化p38 MAPK的相對表達量升高，磷酸化NF-кB p65的表達降低，進一步證明鎘誘發了自由基的產生，使機體產生氧化損傷。Luo等[59]對乙醇誘導的小鼠細胞內氧化應激進行COS處理后發現，COS可通過抑制p38 MAPK的磷酸化和調控Nrf2的活化，影響下游抗氧化酶的表達，進而清除細胞內積累的ROS。在本試驗中，相較氯化鎘造模組，COS添加在一定程度上抑制了小鼠肝臟組織p38 MAPK的磷酸化水平，和Luo等[59]的發現一致。研究表明，機體處于氧化應激狀態時，Nrf2進入細胞核參與抗氧化反應[60]，機體恢復穩態后Nrf2轉移回細胞質中，并通過泛素化降解或負反饋調節回歸正常水平[61]。本試驗數據顯示，對急性鎘暴露小鼠進行COS處理后，小鼠肝臟細胞中Nrf2的表達顯著降低，這可能因為COS在激活機體抗氧化系統的同時，降低了肝臟組織ROS含量，使機體內恢復氧化還原穩態。根據本研究結果，我們初步推斷：鎘暴露引起小鼠細胞內ROS的產生，誘導MAPK信號通路激活，進而導致其中細胞外信號調節激酶p38 MAPK的激活，激活后的磷酸化的p38 MAPK信號分子主要調動細胞氧化應激和炎癥反應，說明大量鎘蓄積導致肝臟處于急性的炎癥活躍期。同時，肝臟在鎘誘導的過量ROS的刺激下負反饋抑制磷酸化NF-κB的激活，提高氧化應激關鍵信號分子Nrf2的表達，減慢炎癥發展的速度。機體添加COS后p38的磷酸化水平降低，緩解了肝臟的炎癥程度，同時通過抑制磷酸化NF-κB的表達，使Nrf2的表達下降至正常水平，從而維持肝臟的氧化還原穩態(圖7)。

圖7 Cd和COS聯合作用下小鼠肝臟p38 MAPK/NF-кB p65/Nrf2氧化應激相關信號通路注：ERK-1/2表示細胞外信號調節激酶；SAPK表示應激活化蛋白激酶；JNK表示c-Jun氨基末端激酶；黑色實線表示Cd產生的影響，紅色實線表示COS產生的影響。Fig.7 Oxidative stress related signaling pathways of p38 MAPK/NF-кB p65/Nrf2 in mouse liver under the combined action of Cd and COSNote:ERK stands for extracellular regulated kinase,SAPK stands for stress-activated protein kinase,and JNK stands for c-Jun N-terminal kinase;the black solid line shows the effect of Cd,and the red solid line shows the effect of COS.

綜上所述，COS可通過調控肝臟主要抗氧化信號通路，來緩解鎘對小鼠的應激，減少肝臟組織氧化損傷，達到保護肝臟組織的目的。為COS調控重金屬富集的機制研究提供了實驗數據支持，為天然多糖類復合物作為生物解毒劑應用于重金屬暴露的動物和人體提供依據。