基于網絡藥理學和分子對接技術探討清眩降壓湯治療原發性高血壓的作用機制

于宗良，李曉雅，2，張曉囡，馬 鶴，2，王澤平，2，吳 敏，劉龍濤

原發性高血壓是以體循環動脈壓升高為主要臨床表現的心血管疾病，常可造成多個靶器官損傷，并發冠心病、糖尿病等慢性疾病，是急性腦血管事件的獨立危險因素之一[1]。近年來，隨著人們生活方式的變化，我國高血壓發病率呈逐年上升趨勢，根據《中國心血管病報告2018》測算，我國高血壓病人約2.45億人，成年人高血壓患病率高達27.9%，而控制率僅為16.8%[2-3]。原發性高血壓的具體發病機制尚不完全清楚，目前無根治措施，主要以穩定降壓、減少并發癥發生為主要目的[4]。中醫藥作為聯合治療原發性高血壓的重要手段，能夠多靶點、多通路發揮降壓作用，對于防止靶器官損害具有獨特優勢[5-7]。清眩降壓湯由苦丁茶、天麻、鉤藤、桑葉、菊花、黃芩、夜交藤、杜仲、生地黃、牛膝十味藥物組成，是陳可冀院士治療原發性高血壓的數十年的經驗總結，臨床應用效果確切。本研究采用網絡藥理學和分子對接方法，探究清眩降壓湯治療原發性高血壓的關鍵靶點和通路，為進一步研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 清眩降壓湯相關靶點篩選 以苦丁茶、天麻、鉤藤、桑葉、菊花、黃芩、夜交藤、杜仲、生地黃、牛膝為關鍵詞檢索中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，根據口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug likeness，DL)≥0.18的2個藥物動力學參數進行篩選以獲得活性成分。檢索中醫藥綜合數據庫(TCMID)、傳統中藥百科全書數據庫(ETCM)挖掘藥物成分數據及已發表的相關文獻中研究較為成熟但參數未達到要求的活性成分，統一在TCMSP平臺檢索活性成分蛋白質靶點。根據已發表的文獻補充未預測的活性成分已知靶點，并在UniProt蛋白質數據庫對靶點進行規范。

1.2 原發性高血壓相關靶點篩選 以hypertension、essential hypertension、spontaneous hypertension等關鍵詞，檢索GeneCards數據庫中治療原發性高血壓的潛在靶點，根據經驗設定Score值排序前1/4的目標靶點為原發性高血壓潛在靶點，并通過OMIM數據庫、TTD數據庫及DrugBank數據庫進行補充[8]。合并4個數據庫靶點后，刪除重復值，獲得原發性高血壓相關靶點。

1.3 清眩降壓湯成分-原發性高血壓靶點蛋白相互作用(PPI)網絡構建 利用Venny 2.1將清眩降壓湯中藥作用靶點與原發性高血壓靶點取交集并繪制韋恩圖，得到清眩降壓湯成分-原發性高血壓共同靶點。將交集靶點提交至STRING 11.0數據庫構建PPI模型，生物種類設為“Homo sapiens”，最小作用閾值設定為“highest confidence”(>0.9)，假陽性率(FDR)嚴格設定為“high”(<1%)，其余設置默認，得到PPI網絡[9]，導入Cytoscape 3.7.2進行網絡圖的繪制。

1.4 清眩降壓湯成分-原發性高血壓靶點功能與通路的富集分析 將清眩降壓湯調節原發性高血壓的靶點錄入Metascape平臺[10-11]，設置P<0.01，分析其主要的生物學過程與代謝通路并進行富集分析，通過Bioinformatics平臺實現可視化。

1.5 清眩降壓湯成分-原發性高血壓靶點-通路網絡圖構建 利用Cytoscape 3.7.2構建清眩降壓湯成分-原發性高血壓靶點-通路網絡圖，利用Cytoscape 3.7.2內置工具分析有效成分、靶點和通路的網絡拓撲參數，并分析核心靶點及發揮藥效的主要活性成分。

1.6 分子對接驗證 選取Cytoscape 3.7.2分析結果度值排名前10位的活性成分和靶點進行分子對接驗證。PubChem和PDB平臺獲取小分子配體和蛋白受體，以分辨率高和參考文獻支持為篩選條件。通過ChemOffice對小分子配體能量最小化處理，通過PyMOL對蛋白配體進行移除水分子、小分子配體，AutoDockTools加氫、計算電荷并設置為剛性分子。選中所有活性位點，通過AutoDockTools設置對接盒子進行分子對接[12]，OpenBabel實現可視化，最后通過PLIP平臺確定結合位點并可視化處理。

2 結 果

2.1 清眩降壓湯相關靶點篩選 篩選后共獲得苦丁茶活性成分11種、天麻活性成分13種、鉤藤活性成分37種、桑葉活性成分33種、菊花活性成分26種、黃芩活性成分37種、夜交藤活性成分14種、杜仲活性成分33種、生地黃活性成分19種、牛膝活性成分23種，各中藥重復成分見圖1，合并后刪除重復值，得到活性成分共計199種。苦丁茶作用靶點148個，天麻作用靶點41個，鉤藤作用靶點176個，桑葉作用靶點191個，菊花作用靶點206個，黃芩作用靶點90個，夜交藤作用靶點153個，杜仲作用靶點170個，生地黃作用靶點49個，牛膝作用靶點173個，合并后刪除重復值，得到靶點共計281個。

圖1 清眩降壓湯不同中藥重復成分統計

2.2 原發性高血壓相關靶點篩選 在GeneCards數據庫得到原發性高血壓相關靶點6 972個，根據經驗設定Score值前1/4的目標靶點為原發性高血壓潛在靶點。結合OMIM、TTD、DrugBank數據庫補充相關靶點，合并后刪除重復值，最終得到1 775個原發性高血壓相關靶點。

2.3 清眩降壓湯成分-原發性高血壓靶點PPI網絡構建 利用Venny 2.1將清眩降壓湯活性成分作用靶點與原發性高血壓靶點取交集并繪制韋恩圖，得到清眩降壓湯成分-原發性高血壓共同靶點173個，詳見圖2。通過STRING 11.0平臺構建蛋白互作模型，導入Cytoscape 3.7.2進行蛋白互作網絡圖構建，清除游離節點，共形成點154個、邊728條，平均點度值8.42，平均聚類系數0.45，圖3展示度值大于20的節點網絡。

圖2 清眩降壓湯-原發性高血壓作用靶點韋恩圖

圖3 清眩降壓湯-原發性高血壓靶點PPI網絡(度值>20)(節點面積越大、顏色越深表示度值越大，提示節點越重要)

2.4 清眩降壓湯成分-原發性高血壓靶點功能與通路的富集分析 基因本體(GO)功能富集分析得到條目2 705個，其中生物過程(BP)條目2 391個，細胞組成(CC)條目120個，分子功能(MF)條目194個，分別占88.4%、4.4%、7.2%，詳見圖4。京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集篩選得到355條信號通路(見圖5)。清眩降壓湯成分參與的BP主要包括血管發育、對細胞外刺激的反應、對氧化應激的反應、對細胞運動的正向調節等。MF主要包括蛋白質均二聚活性、氧化還原酶活性、腎上腺素能受體活性、脂質結合、輔因子結合等。參與的相關通路主要有絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、白細胞介素-17(IL-17)信號通路、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路等，富集結果前20位相關靶點通路見表1。

表1 清眩降壓湯調節原發性高血壓通路富集分析

2.5 清眩降壓湯成分-原發性高血壓靶點-通路網絡圖構建 通過Cytoscape 3.7.2構建清眩降壓湯成分-原發性高血壓靶點-通路網絡圖，圖6展示了度值排名前5%的活性成分、靶點和通路網絡。網絡分析顯示，槲皮素度值為92，介度為0.194，緊密度為0.487，預測槲皮素可能為清眩降壓湯治療原發性高血壓的主要活性成分，其次為芹菜素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素和大黃素等，詳見表2。PTGS2在網絡中度值為125，介度為0.227，緊密度為0.497，預測PTGS2為清眩降壓湯治療原發性高血壓的最重要靶點。環加氧酶1(PTGS1)、雄激素受體(AR)、MAPK1、MAPK3、AKT1、一氧化氮合酶2(NOS2)、PRKCA、MAPK14、RELA等亦為相對重要的靶點，詳見表3。

圖6 清眩降壓湯活性成分-原發性高血壓靶點-通路網絡圖(度值排名前5%)(藍紫色節點代表作用靶點，粉色節點代表通路，淡紅色節點代表活性成分，節點面積代表度值，面積越大說明節點越重要)

表2 清眩降壓湯主要活性成分藥物特征及網絡節點特征參數

表3 清眩降壓湯主要成分靶點網絡節點特征參數

2.6 分子對接驗證 根據度值，選取排名前10位的活性成分與靶點進行分子對接驗證，結合能越低，分子結合越穩定，對接效果越好，一般認為結合能低于-29.3 kJ/mol提示對接穩定。如圖7所示，槲皮素、山奈酚、木犀草素與排名前10位的靶點均對接良好。大黃素與MAPK3、RELA結合能低于-41.8 kJ/mol，為對接效果最好的活性成分與靶點，其次為木犀草素與PTGS1、槲皮素與PTGS2，以及山奈酚與PTGS2，對接結合能均低于-39.7 kJ/mol。針對對接效果最好的五對分子-靶點對接進行可視化處理，可以看出結合以疏水鍵的相互作用和氫鍵為主，與在大黃素與RELA、木犀草素與PTGS1的對接中還存在π堆積作用，詳見圖8。

圖7 清眩降壓湯活性成分-原發性高血壓靶點分析對接聚類熱圖

圖8 清眩降壓湯活性成分-原發性高血壓靶點分子對接及對接位點示意圖(A為大黃素與MAPK3對接結果；B為大黃素與RELA對接結果；C為木犀草素與PTGS1對接結果；D為槲皮素與PTGS2對接結果；E為山奈酚與PTGS2對接結果)

3 討 論

原發性高血壓發病率呈逐年上升趨勢，且病人依從性差、疾病控制率低，常可導致多種急性并發癥，嚴重威脅公眾健康[13]。中藥聯合治療高血壓能夠有效提高血壓控制率，在改善癥狀、減少并發癥方面具有獨特優勢[14]。清眩降壓湯由苦丁茶、天麻、鉤藤、桑葉、菊花、黃芩、夜交藤、杜仲、生地黃、牛膝十味藥物組成，是陳可冀院士治療原發性高血壓的經驗方，臨床應用效果確切。臨床研究證實，聯合使用清眩降壓湯能夠有效降低原發性高血壓病人全天收縮壓和舒張壓，顯著降低中醫證候積分，治療肝陽上亢型、肝腎陰虛型原發性高血壓療效顯著[15-16]。另有研究發現，清眩降壓湯在治療圍絕經期原發性高血壓、青年高血壓及老年高血壓方面同樣可以發揮良好效果，能夠有效改善病人癥狀，降低中醫證候評分及血清血管緊張素Ⅱ、同型半胱氨酸水平[17-19]。由此可見，清眩降壓湯治療原發性高血壓證型廣泛，臨床效果確切。大量實驗研究對清眩降壓湯生物學機制進行了探討。如林珊等[20]采用大鼠離體胸主動脈環進行研究證實，清眩降壓湯能夠有效舒張血管，明顯降低離體血管環收縮力。而在體實驗研究則發現，清眩降壓湯能夠有效控制自發性高血壓模型大鼠血壓的進一步升高，減小血管中膜厚度，改善血壓升高導致的動脈血管重構，其機制與降低Bcl-2蛋白表達、抑制血管平滑肌細胞增殖有關[21]。類似的研究則認為，清眩降壓湯逆轉自發性高血壓大鼠血管重塑的機制可能與調節轉化生長因子β1(TGF-β1)/Smad通路及誘導血管平滑肌細胞凋亡有關[22-23]。整體而言，清眩降壓湯治療原發性高血壓臨床效果顯著，其改善血管重構的機制主要與調節平滑肌細胞增殖與凋亡有關，而針對清眩降壓湯的降壓機制仍有待深入研究。

本研究通過網絡藥理學方法，初步篩選出清眩降壓湯調節原發性高血壓的活性成分為槲皮素、芹菜素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素和大黃素等。基礎研究發現槲皮素能夠降低自發性高血壓大鼠收縮壓，降低左室相對質量，并能夠逆轉高血壓引起的心肌纖維破壞和線粒體損傷，其機制與激活過氧化物酶增殖體激活受體(PPAR-γ)抑制核轉錄因子-κB(NF-κB)的表達，進而調節其下游肥厚基因心鈉肽(ANP)、腦鈉肽(BNP)mRNA的表達有關[24]。周秀等[25]的研究則認為，槲皮素改善高血壓誘導的心肌重構機制與調節腸道菌群下調Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB途徑有關。木犀草素的降壓機制研究相對較早，主要與調節離子通道、抑制炎性因子表達和抑制醛糖還原酶活性有關[26]，目前研究主要集中于木犀草素的腎性高血壓心肌保護機制[27-28]。針對山奈酚的研究則證實了其良好的血管舒張作用，其機制可能與一氧化氮(NO)-環磷酸鳥苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信號通路有關[29]。芹菜素和大黃素的降壓機制研究近年來得到了研究人員的廣泛關注，研究發現芹菜素能夠有效控制高脂高鹽誘導的大鼠血壓增高，改善高血壓引起的心臟肥大，其作用機制可能與降低大鼠血管緊張素Ⅱ水平、改善抗氧化酶活性有關[30-31]。同時，芹菜素抗氧化應激作用能夠有效減輕高血壓誘導的腎間質纖維化及膠原沉積，發揮靶器官保護效應[32]，與大黃素的腎臟保護機制具有一致性[33-35]。本研究分子對接結果同樣證實，槲皮素、木犀草素、山奈酚、大黃素等活性成分與主要靶點能夠以疏水鍵的相互作用、氫鍵、π堆積作用發生對接結合，且結合強度較高。由此可見，清眩降壓湯的降壓作用可能是通過槲皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素和大黃素實現的。

本研究發現，清眩降壓湯調控原發性高血壓的主要靶點是PTGS2、PTGS1、AR、MAPK1、MAPK3、RELA等，主要為炎癥應答、細胞增殖與凋亡、細胞因子轉導相關靶點，與近年來原發性高血壓慢性炎癥過程的認識具有一致性[36]。清眩降壓湯參與的生物過程主要包括血管發育、對細胞外刺激的反應、對氧化應激的反應等，分子功能主要包括氧化還原酶活性、脂質結合、輔因子結合等，均與炎癥應答、氧化應激及代謝調節有關。涉及的生物學通路主要作用有MAPK、IL-17、PI3K-Akt、TNF等。近年來的研究表明，MAPK、TNF等炎性信號通路廣泛參與了高血壓心臟重構與血壓調節過程[37]，并與PI3K-Akt等細胞周期信號通路協同作用，調節高血壓大鼠血管內皮氧化應激損傷、平滑肌表型轉化和膠原重構的過程[38-40]。故推測清眩降壓湯主要通過調節MAPK信號通路、TNF信號通路等炎癥通路及PI3K-Akt等細胞周期信號通路實現降壓作用。

本研究借助網絡藥理學方法，分析清眩降壓湯調節原發性高血壓的機制。結果表明清眩降壓湯的同一化合物可調控不同靶點，而同一靶點可干預不同的生物學過程及信號通路，體現了清眩降壓湯多通路、多靶點聯合作用調節血壓的特點，為清眩降壓湯治療原發性高血壓提供了科學依據和發掘清眩降壓湯潛在作用機制的基礎。但是網絡藥理學作為大數據背景下的新興研究方法，主要通過數據挖掘方法進行活性成分和靶點關聯的預測，可能與實驗研究有一定出入，通過分子對接方法驗證其預測結果具有重要意義。本課題組在借助數據庫分析預測清眩降壓湯治療原發性高血壓可能存在的靶點、通路等的基礎上，進一步對篩選出的相關基因及蛋白進行驗證，從細胞及分子層面明確清眩降壓湯通過炎癥通路、細胞周期信號調控原發性高血壓的作用機制，為清眩降壓湯治療原發性高血壓的中藥組方的臨床應用提供理論依據。