NEAT1/miR-193a-3p通過TLR-4/NF-κB信號通路對脂多糖誘導的心肌H9c2細胞損傷的影響

曾羽霄，莊少偉

多種心肌疾病中均存在心肌細胞凋亡的現象。心肌細胞凋亡、炎癥可造成急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)進一步加重并引發心肌功能障礙、心力衰竭等，導致病人死亡風險升高[1]。近年來的研究發現，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNAs)和短非編碼RNA(miRNAs)在生物過程中發揮重要的作用。lncRNA是一類長度大于200多個核苷酸的轉錄RNA分子，參與調控細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為。NEAT1是一種長度約為3 700 nt的lncRNA，定位于11q13.1，與mRNA前體剪接區域 SC-35有密切聯系，研究顯示NEAT1參與調節細胞增殖、凋亡和遷移等多種癌癥相關的細胞活動[2]。最近研究顯示，NEAT1可通過產生腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)促進炎癥反應[3]。miRNA為18～25個核苷酸之間的內源性短鏈非編碼RNA分子，主要結合 mRNA 的非翻譯區，下調或者抑制mRNA的轉錄與翻譯，進而調控下游靶基因的表達，參與各種疾病的病理過程[4]。miR-193a-3p來源于miR-193家族，其抗腫瘤活性已在肺癌和腎細胞癌等各種癌癥研究中廣泛報道[5]。競爭性內源RNA(ceRNA)假說的提出讓人們對lncRNAs和miRNAs之間的作用機制有了新的認識。當前研究表明，lncRNA可作為ceRNA并競爭性結合到miRNA，從而調節mRNA的轉錄水平并調節基因表達[6]。已有研究顯示，NEAT1作為ceRNA并結合miR-193a-3p以加速肺腺癌惡化[7]。但是NEAT1和miR-193a-3p在心肌細胞損傷是否存在某種調控關系及其作用機制尚不明確。本研究用脂多糖(LPS)處理心肌H9c2細胞建立心肌細胞損傷模型，探討NEAT1/miR-193a-3p在心肌細胞損傷中的作用，并且分析其影響炎性損傷的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 胚胎大鼠心肌H9c2細胞，購自上海匹拓生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 脂多糖購自上海廣銳生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM培養液和胰蛋白酶購自美國Gibico公司；Trizol試劑和Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；細胞計數試劑盒-8(CCK-8)試劑盒、增強型化學發光(ECL)試劑盒和RIPA 蛋白裂解液購自中國上海碧云天生物技術有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒購自中國南京碧云天生物技術有限公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司；SYBR Green qPCR試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國R&D Systems公司；pcDNA-NEAT1、NEAT1 control、miR-193a-3p mimic和miR-193a-3p control購自上海吉瑪制藥技術有限公司；PrimeScriptTM逆轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMII購自日本TaKaRa公司；Super SignalTM化學發光底物購自美國Thermo Scientific公司；Toll樣受體-4(Toll-like receptor-4，TLR-4)抗體、骨髓分化主要反應蛋白88(myeloid differentiation primary response 88，MYD88)抗體、核因子-κB p65(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B，NF-κB p65)抗體、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)抗體、β-actin兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶-羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗均購自美國CST公司；TNF-α、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6和白細胞介素-8(IL-8)試劑盒均購自江蘇科晶生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 -80 ℃冰箱購自日本SANYO公司；二氧化碳(CO2)恒溫培養箱購自美國Precision公司；PT-3502A 酶標儀購自北京普天新橋技術有限公司；FACSAria flow流式細胞儀購自美國BD Biosciences公司；Step One PlusTMreal-time PCR System購自美國 Applied Biosystems公司；凝膠掃描分析系統購自英國 Syngene 公司；蛋白質免疫印跡法(Western Blot)電泳和轉膜系統、ChemiDoc 成像系統購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 雙熒光素酶報告基因試驗 通過LncBase(www.microrna.gr/LncBase)預測NEAT1的靶基因，發現miR-193a-3p和NEAT1的3′非編碼區域(3′- untranslated region，3′ UTR)存在互補的核苷酸序列。分別將含有野生型NEAT1(NEAT1-WT)和突變型NEAT1(NEAT1-MUT)質粒和miR-193a-3p mimic或者 NC mimic共轉染至H9c2細胞內，轉染48 h后采用Bright- GloTM熒光素酶試劑盒確認熒光素酶活性，使用酶標儀檢測熒光強度。

1.2.2 RNA結合蛋白免疫沉淀試驗 按照生產商RNA結合蛋白免疫沉淀配套所用EZ-Magna rip Kit說明書進行操作。在DMEM培養液中加入EZ-Magna rip Kit的蛋白酶抑制劑和RNA裂解緩沖液進行細胞裂解。根據說明書進行RNA免疫沉淀。然后將抗Argonaute2(Ago2)抗體和正常小鼠IgG結合的磁珠孵育在RNA免疫沉淀緩沖液中進行孵育。然后加入細胞裂解液，用蛋白酶K緩沖液處理各標本，同時分離被沉淀的RNA。后續進行逆轉錄，采用聚合酶鏈式反應(PCR)法檢測NEAT1和miR-193a-3p水平。

1.2.3 心肌細胞炎性損傷模型的建立 H9c2細胞用含10%胎牛血清、DMEM培養液于37 ℃、含有5%CO2的細胞培養箱中傳代培養。收集對數生長期細胞，分別用不同濃度(0.0 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL和2.0 μg/mL)的脂多糖刺激細胞24 h，然后通過CCK-8試驗和流式細胞術測定各組細胞的活力，并且采用RT-PCR法測定細胞中NEAT1和miR-193a-3p mRNA的表達水平。選擇合適的脂多糖進行后續試驗。

1.2.4 細胞分組和轉染 將胚胎大鼠心肌H9c2細胞用含10%胎牛血清、DMEM培養液于37 ℃、含有5%CO2的細胞培養箱中傳代培養。收集對數生長期細胞，將細胞分為miR-193a-3p mimic組、miR-193a-3p control組、NEAT1組、NEAT1 control組、miR-193a-3p mimic + NEAT1組、正常對照組以及模型對照組，參照Lipofectamine 2000 說明書步驟進行轉染操作，分別利用轉染試劑 Lipofectamine 2000將miR-193a-3p mimic、miR-193a-3p control、pcDNA-NEAT1、NEAT1 control以及miR-193a-3p mimic+pcDNA-NEAT1轉染至細胞中，正常對照組和模型對照組細胞未進行任何轉染。

1.2.5 CCK-8試驗 各組細胞經脂多糖處理24 h后，加入CCK-8試劑，用酶標儀檢測各孔450 nm處光密度OD值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。

1.2.6 流式細胞術實驗 各組細胞轉染后常規培養6 h，除正常對照組外，其余各組用含脂多糖(1 μg/mL)的新鮮DMEM培養液培養24 h，離心收集細胞。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸細胞，離心棄去上清液，重復兩次。使用100 μL的Binding Buffer懸浮細胞，再加入5 μL的 Annexin V-FITC和5 μL的熒光染料碘化甲啶，避光孵育15 min后，用Binding Buffer重懸細胞，使用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。

1.2.7 RT-PCR實驗 各組細胞轉染后常規培養6 h，除正常對照組外，其余各組用含脂多糖(1 μg/mL)的新鮮DMEM培養液培養24 h，離心收集細胞。加入Trizol 液提取總RNA，異丙醇法濃縮 RNA，采用全自動酶標儀測定總RNA純度，控制A260/A280在1.9～2.1，RNA 電泳檢測其完整性。檢測濃度及純度后取2 μg總RNA應用逆轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA。逆轉錄條件如下：37 ℃ 反應15 min，85 ℃反應5 s。將逆轉錄所得cDNA純化后應用Step One PlusTMreal-time PCR System進行PCR擴增。反應總體積為20 μL∶1.5 μL cDNA 模板，1 μL 引物，10 μL SYBR?Premix Ex TaqTMII，7.5 μL H2O。PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s，擴增循環 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s，共40 個循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為參照，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對定量表達量。

1.2.8 Western Blot實驗 各組細胞轉染后常規培養6 h，除正常對照組外，其余各組用含脂多糖(1 μg/mL)的新鮮DMEM培養液培養24 h，離心收集細胞。用RIPA裂解液裂解各組細胞，離心，使用 BCA 法測定蛋白濃度。蛋白變性后按每孔20 μg進行10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)凝膠電泳(90 V 30 min，120 V 1 h)。電泳后濕法轉至聚偏二氟乙烯膜(PVDF，400 mA，2h)，用5%BSA封閉1 h，TBST緩沖液洗膜，分別加入一抗后4 ℃過夜，TBST緩沖液充分洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗后室溫下孵育1 h，TBST緩沖液充分洗膜30 min，用化學發光試劑盒顯色，顯影。測定各組細胞目標蛋白表達量，以與β-actin條帶相對表達量表示。

1.2.9 ELISA試驗 各組細胞轉染后常規培養6 h，除正常對照組外，其余各組用含脂多糖(1 μg/mL)的新鮮DMEM培養液培養24 h，收集各組細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書要求操作，測定各組細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8含量。

2 結 果

2.1 miR-193a-3p和NEAT1靶向的關系 在轉染miR-193a-3p mimic的H9c2細胞中野生型NEAT1報告基因的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而突變報告基因的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。熒光素酶報告基因結果證實NEAT1 可以作為 ceRNA 靶向結合miR-193a-3p。詳見圖1。

與突變型序列(3′URT-MUT)比較，＊P<0.01。圖1 H9c2細胞轉染miR-193a-3p mimic后野生型和突變型NEAT1報告基因熒光素酶活性比較

2.2 免疫沉淀試驗結果 與IgG免疫沉淀物對照相比，H9c2細胞中miR-193a-3p和NEAT1在Ago2免疫沉淀物中富集。結合熒光素酶報告基因結果，進一步證明miR-193a-3p是H9c2細胞中NEAT1的結合靶點。詳見圖2。

與IgG免疫沉淀物對照比較，＊ P<0.01。圖2 免疫沉淀試驗結果

2.3 脂多糖對H9c2細胞活力、NEAT1和miR-193a-3p mRNA表達的影響 當脂多糖濃度達到1 μg/mL和2.0 μg/mL時H9c2細胞活力明顯降低(P<0.05或P<0.01)，特別當脂多糖濃度達到2.0 μg/mL時H9c2細胞活力降低超過50%。隨著脂多糖濃度的增加，H9c2細胞中miR-193a-3p mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)，而NEAT1 mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)，因此，NEAT1和miR-193a-3p可能參與脂多糖誘導的H9c2細胞損傷。詳見圖3～圖5。

與0.0 μg/mL比較，＊P<0.05，#P<0.01。圖3 脂多糖對H9c2細胞活力的影響(n=6)

與0.0 μg/mL比較，＊P<0.01。圖4 脂多糖對H9c2細胞miR-193a-3p mRNA表達的影響(n=6)

與0.0 μg/mL比較，＊P<0.01。圖5 脂多糖對H9c2細胞NEAT1 mRNA表達的影響(n=6)

2.4 各組H9c2細胞中NEAT1和miR-193a-3p mRNA表達比較 將miR-193a-3p mimic轉染至H9c2細胞中可使miR-193a-3p mRNA表達水平明顯增加(P<0.01)，同時可使NEAT1 mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)；而將pcDNA-NEAT1轉染至H9c2細胞中可使NEAT1 mRNA表達升高(P<0.01)，同時可使miR-193a-3p mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)。詳見圖6。

模型對照組與正常對照組比較，＊P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.01。圖6 各組H9c2細胞中NEAT1和miR-193a-3p mRNA表達比較(n=6)

2.5 NEAT1/miR-193a-3p對脂多糖所致H9c2細胞活力和細胞凋亡的影響 將miR-193a-3p mimic 轉染至H9c2細胞后可改善H9c2細胞因脂多糖刺激導致的細胞活力降低和細胞凋亡增加(P<0.01)，而將pcDNA-NEAT1轉染至H9c2細胞可逆轉miR-193a-3p mimic對細胞活力和凋亡的調節作用(P<0.01)。因此，過表達miR-193a-3p可改善H9c2細胞因脂多糖刺激導致的細胞活力降低和細胞凋亡增加，而過表達NEAT1可逆轉miR-193a-3p對細胞活力和凋亡的調節作用。詳見圖7、圖8。

模型對照組與正常對照組比較，＊P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.01；與miR-193a-3p mimic組比較，△ P<0.01。圖7 NEAT1/miR-193a-3p對脂多糖所致H9c2細胞活力的影響(n=6)

模型對照組與正常對照組比較，＊P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.01；與miR-193a-3p mimic組比較，△ P<0.01。圖8 NEAT1/miR-193a-3p對脂多糖所致H9c2細胞凋亡的影響(n=6)

2.6 NEAT1/miR-193a-3p對脂多糖所致H9c2細胞分泌炎性因子的影響 將miR-193a-3p mimic 轉染至H9c2細胞后可使升高的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平明顯降低(P<0.01)，而將pcDNA-NEAT1轉染至H9c2細胞可逆轉miR-193a-3p mimic對TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的調節作用(P<0.01)。因此，過表達miR-193a-3p可降低H9c2細胞因脂多糖刺激導致的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平升高，而過表達NEAT1可逆轉miR-193a-3p對TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平的調節作用。詳見圖9。

模型對照組與正常對照組比較，＊P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.01；與miR-193a-3p mimic組比較，△ P<0.01。圖9 NEAT1/miR-193a-3p對脂多糖所致H9c2細胞炎性因子分泌的影響(n=6)

2.7 NEAT1/miR-193a-3p對脂多糖所致H9c2細胞中TLR-4/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響 將miR-193a-3p mimic 轉染至H9c2細胞后可使升高的TLR-4、MYD88和p-NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，而將pcDNA-NEAT1轉染至H9c2細胞可逆轉miR-193a-3p mimic對TLR-4、MYD88和p-NF-κB p65蛋白表達的調節作用(P<0.01)，但是miR-193a-3p mimic 和pcDNA-NEAT1轉染對NF-κB p65蛋白表達水平無明顯影響(P>0.05)。因此，過表達miR-193a-3p可降低H9c2細胞因脂多糖刺激導致的TLR-4、MYD88和p-NF-κB p65蛋白表達水平升高，而過表達NEAT1可逆轉miR-193a-3p對TLR-4、MYD88和p-NF-κB p65蛋白表達水平的調節作用，但是過表達miR-193a-3p或過表達NEAT1對NF-κB蛋白表達水平無影響。詳見圖10。

模型對照組與正常對照組比較，＊P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.01；與miR-193a-3p mimic組比較，△ P<0.01。圖10 NEAT1/miR-193a-3p對脂多糖所致H9c2細胞中TLR-4/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響(n=6)

3 討 論

多種miRNA可通過調節心肌細胞炎癥、纖維化、細胞自噬、細胞凋亡及新生血管形成的表型機制參與心臟疾病的發生和發展[8-9]。Eguchi等[10]研究顯示，心肌細胞外泌體中的miRNA-214具有抗細胞凋亡作用，心肌細胞通過網格蛋白介導的內吞作用捕獲miRNA-214從而抑制心肌細胞凋亡。miRNA-488-3p 通過靶向ZNF791 抑制急性心肌梗死后的心肌細胞凋亡[11]。miR-325-3p 通過受體相互作用蛋白激酶1(RIPK1)/受體相互作用蛋白激酶3(RIPK3)/人磷酸化混合系列蛋白激酶樣結構域(p-MLKL)途徑抑制壞死性凋亡，抑制RIPK3的表達和程序性壞死，保護心肌梗死后的心臟[12]。miR-193a-3p來源于miR-193家族，其抗腫瘤活性已廣泛報道，但是在心肌細胞損傷中的作用鮮有報道。lncRNA 是一種非編碼RNA，在真核細胞內被普遍轉錄，其表達具有組織特異性，與動脈粥樣硬化、慢性心力衰竭等心血管疾病的發生發展密切相關。隨著對lncRNA的深入研究，許多研究結果表明其在炎癥介質產生及炎癥細胞分化、遷移等多種生物過程中起重要作用。Zhang等[13]報道抑制NEAT1可明顯降低脂多糖誘導的趨化因子和細胞因子的表達。張飛飛等[14]探索NEAT1在先天免疫反應中的作用，結果表明NEAT1參與Toll樣受體-2(TLR-2)介導的先天免疫調節，并且選擇性地調控TLR-2信號活化緩慢持續誘導的晚期反應炎性因子的表達。Chen等[15]研究顯示，NEAT1可通過調節NF-κB通路影響膿毒癥誘導的急性腎細胞凋亡和炎癥反應。

lncRNA可作為ceRNA并競爭性結合到miRNA，而NEAT1作為ceRNA并結合miR-193a-3p[7]。本研究通過熒光素酶報告基因結果證實NEAT1 可以作為ceRNA 靶向結合miR-193a-3p，并且免疫沉淀試驗進一步證明miR-193a-3p是H9c2細胞中NEAT1的結合靶點。目前，關于NEAT1和miR-193a-3p在心肌細胞損傷的作用鮮有報道。本研究結果顯示，脂多糖可致H9c2細胞活力明顯降低，并且細胞中miR-193a-3p mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)，而NEAT1 mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)，說明NEAT1和miR-193a-3p可能參與脂多糖誘導的H9c2細胞損傷。通過轉染miR-193a-3p mimic或pcDNA-NEAT1至H9c2細胞，改變細胞中miR-193a-3p mRNA和NEAT1 mRNA的表達水平，過表達miR-193a-3p可改善H9c2細胞因脂多糖刺激導致的細胞活力降低和細胞凋亡增加，而過表達NEAT1可逆轉miR-193a-3p對細胞活力和凋亡的調節作用。IL-6、TNF-α等炎性因子水平升高導致心肌功能紊亂及心肌細胞凋亡、壞死[16]。炎癥反應是包括心肌細胞在內的多種細胞凋亡、壞死的重要病理改變，降低細胞炎性因子含量有助于減輕細胞損傷。本研究結果顯示，過表達miR-193a-3p可降低H9c2細胞因脂多糖刺激導致的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平升高，而過表達NEAT1可逆轉miR-193a-3p對TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平的調節作用。因此，miR-193a-3p和NEAT1在H9c2細胞損傷中發揮相反的作用，NEAT1可反向調節miR-193a-3p在心肌細胞損傷中的作用。

越來越多的研究表明，TLR-4/NF-κB信號通路可調節細胞增殖和細胞凋亡，是涉及免疫和炎癥反應的重要細胞信號傳導通路，并且是細胞凋亡引起炎癥性損傷的原因[17]。TLR-4是一種在天然免疫和炎癥反應中起重要作用的模式識別受體，革蘭陰性菌可被TLR-4特異性識別，并激活TLR-4招募MYD88，導致NF-κB抑制蛋白IκBα磷酸化，NF-κB從復合物上解離，最后NF-κB 進入細胞核內與靶基因結合，刺激TNF-α、IL-6 和IL-1β等炎性因子的生成[18]，進一步誘導炎癥反應[19]，導致血管內皮細胞功能障礙和組織氧化損傷，進一步促使血管內皮細胞衰老、死亡，誘導血管內皮功能紊亂，進而誘發動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病[20]。使TLR-4/NF-κB信號通路失活一直是抑制炎癥的有效方法和治療靶點。Zhang等[21]研究顯示，聚乙二醇可通過阻斷TLR-4/NF-κB改善脂多糖誘導的神經炎癥。下調lncRNA MALAT1可通過抑制TLR-4/NF-κB介導的炎癥反應，減輕飽和脂肪酸誘導的心肌炎癥損傷[22]。Pan等[23]研究顯示，miR-21可抑制TLR-4/NF-κB通路，以減少心肌細胞凋亡和炎性因子生成。在本研究中，過表達miR-193a-3p可降低H9c2細胞因脂多糖刺激導致的TLR-4、MYD88和p-NF-κBp65蛋白表達水平升高，而過表達NEAT1可逆轉miR-193a-3p對TLR-4、MYD88和p-NF-κBp65蛋白表達水平的調節作用，因此，miR-193a-3p可通過調節TLR-4/NF-κB信號通路影響脂多糖誘導的細胞凋亡和炎癥反應，而NEAT1可通過調節miR-193a-3p發揮其作用。因此，NEAT1可能通過海綿化miR-193a-3p來調節TLR-4/NF-κB信號通路的活化，從而減輕脂多糖誘導的炎癥和細胞凋亡，從而影響心肌細胞損傷。

總之，NEAT1通過miR-193a-3p可影響脂多糖誘導的心肌細胞凋亡和炎癥反應，提示NEAT1可作為競爭性內源RNA海綿miR-193a-3p參與心肌損傷過程，并且與調控TLR-4/NF-κB信號通路有關。