冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白A水平與病情程度及預后的關系

楚艷貞，于林君，張彥昂

冠心病是一種以動脈粥樣硬化病變、冠狀動脈管腔狹窄、心肌供血減少為主要病理特征的心腦血管疾病[1]。病人臨床表現為胸悶、胸痛等，嚴重者會伴有心源性哮喘、暈厥等心肌梗死癥狀。目前，冠狀動脈造影檢查是臨床診斷冠心病的金標準，可準確、直觀顯示犯罪血管，但因其屬于有創檢查且費用相對較高，加之心肌本身存在代償功能，發病早期不易被發現，延誤診斷與治療，增加主要心血管不良事件(MACE)發生風險[2-3]。因此，探討簡便易行且靈敏度高的生物標志物對早期診斷冠心病及預后評估尤為關鍵。冠心病的主要病因在于冠狀動脈病變，其中炎癥反應、脂質代謝異常等與冠狀動脈粥樣硬化的發生、發展密切相關[4]。miR-342-5p是早期巨噬細胞豐富病變中高度上調的miRNA之一，廣泛參與炎癥反應、糖脂代謝過程，其可通過介導炎癥反應而發揮抑制蛋白激酶 B1(Akt1)蛋白磷酸化及破壞心肌細胞的作用[5]。潛在轉化生長因子結合蛋白2(LTBP-2)屬于細胞外基質糖蛋白之一，參與彈性纖維凝聚、細胞黏附、機體損傷等過程[6]。細絲蛋白 A(細絲蛋白 A)可介導多種細胞活動，其高表達與炎癥反應中內皮細胞遷移密切相關[7]。但目前臨床上關于miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白 A水平變化與冠心病的關系尚未明確。本研究分析冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白 A水平與病情程度及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年5月—2020年11月于我院治療的95例冠心病病人作為病例組，其中，男54例，女41例；年齡42～81(68.29±4.98)歲；體質指數(BMI)為(23.62±2.19)kg/m2，受教育年限為(10.03±2.46)年；高血壓史26例，糖尿病史9例，飲酒史10例，吸煙史5例；疾病類型：穩定型心絞痛42例，不穩定型心絞痛30例，心肌梗死23例；心功能分級：Ⅱ級49例，Ⅲ級25例，Ⅳ級21例。另選取同期60名健康體檢者作為健康組，其中，男34名，女26名；年齡45～79(69.54±5.25)歲；BMI為(22.62±2.59)kg/m2；受教育年限為(9.65±2.05)年。兩組年齡、性別、BMI、受教育年限比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象自愿簽署知情同意書，本研究獲得我院倫理委員會批準。

1.2 納入標準 符合冠心病[8-10]相關診斷標準，并經冠狀動脈造影檢查，≥1支冠狀動脈血管狹窄≥50%；能配合治療及隨訪。

1.3 排除標準 伴有免疫系統疾病、血液系統疾病、感染性疾病；存在各種急性、慢性感染；既往有冠狀動脈搭橋術、冠狀動脈支架植入術等重大手術史或入組前6個月內接受手術治療；伴有瓣膜性心臟病、心肌病、甲狀腺疾病；惡性腫瘤；合并彌散性血管內凝血、休克等危重狀態；近6個月出現腦梗死或新發腦出血；肝腎功能不全；妊娠期或哺乳期女性。

1.4 研究方法

1.4.1 miR-342-5p檢測 采集兩組空腹肘靜脈血3 mL，置于EDTA抗凝試管，在4 ℃ 3 000 r/min環境下離心10 min，提取上清液。提取血漿中總RNA后參照說明書使用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。使用熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)技術(PRISM 7000型定量PCR儀)檢測miR-342-5p表達水平。反轉錄體系為20 μL，反應條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，重復40個循環，采集熒光，以U6作為內參，U6：正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-342-5p：正向引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGG AGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAATCAC-3′，反向引物為5′-ACACTCCAGCTGGGAGGGGTGCTATCTGT-3′。采用2-ΔΔCt法計算miR-342-5p相對表達量。

1.4.2 血清指標檢測 提取病人血清，通過酶聯免疫吸附法(試劑盒購自美國Beckman公司)檢測兩組血清LTBP-2、細絲蛋白 A、Ⅰ型膠原羧基末端肽(ⅠCTP)、蛋白酶K(CatK)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、白介素(IL)-6、IL-10水平；使用雙抗夾心酶聯免疫吸附法(試劑盒購自湖南普拉特澤生物科技有限公司)檢測兩組腫瘤壞死因子-α(TNF-α)；采用免疫散射比濁法(試劑盒購自上海羽哚生物科技有限公司)測定超敏C反應蛋白(hs-CRP)水平。

1.4.3 Gensini評分 ①病變部位：左主干冠狀動脈病變計5.0分；左前降支或回旋支近段計2.5分；左前降支中段計1.5分；右冠狀動脈、左回旋支中遠段、左前降支遠段計1.0分；第二對角支與后側支計0.5分。②狹窄程度：狹窄≤25%計1分；狹窄26%～50%計2分；狹窄51%～75%計4分；狹窄76%～90%計8分；狹窄91%～99%計16分；100%狹窄計32分。每處病變部位積分為病變部位評分與狹窄程度評分乘積，Gensini評分為所有病變部位積分之和。輕度：Gensini評分為1～20分；中度：Gensini評分為21～40分；重度：Gensini評分>40分。

1.4.4 隨訪 隨訪1年，統計病人心源性死亡、嚴重心律失常、病變血管再狹窄、心肌梗死等MACE發生情況。

2 結 果

2.1 兩組miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A水平比較 病例組miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A水平均高于健康組，差異均有統計學意義(P<0.001)。詳見表1。

表1 兩組miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A水平比較(±s)

2.2 不同病變程度冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A及Gensini評分比較 重度組miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A及Gensini評分均高于中度組、輕度組，中度組miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A及Gensini評分均高于輕度組，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

表2 不同病變程度冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A、Gensini評分比較(±s)

2.3 不同病變程度冠心病病人斑塊穩定性相關指標比較 重度組ⅠCTP、CatK、MMP-2、MMP-9均高于中度組、輕度組，中度組ⅠCTP、CatK、MMP-2、MMP-9均高于輕度組，差異均有統計學意義(P<0.01)。詳見表3。

表3 不同病變程度冠心病病人斑塊穩定性相關指標比較(±s)

2.4 不同病變程度冠心病病人炎性因子水平比較 重度組TNF-α、hs-CRP、IL-6、IL-10水平均高于中度組、輕度組，中度組TNF-α、hs-CRP、IL-6、IL-10水平均高于輕度組，差異均有統計學意義(P<0.01)。詳見表4。

表4 不同病變程度冠心病病人炎性因子水平比較(±s)

2.5 冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A與病情相關指標的相關性 相關性分析顯示，冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A與Gensini評分、斑塊穩定性相關指標、炎性因子指標均呈正相關(P<0.05或P<0.01)。詳見表5。

表5 冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A與病情相關指標的相關性分析

2.6 不同預后冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A比較 MACE組miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A均高于非MACE組，差異均有統計學意義(P<0.001)。詳見表6。

表6 不同預后冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A比較(±s)

2.7 miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A預測冠心病發生及預后的價值 繪制ROC曲線，miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A及三者聯合預測冠心病發生的AUC分別為0.809，0.779，0.770，0.874，預測MACE發生的AUC分別為0.772，0.821，0.754，0.882。詳見表7及圖1、圖2。

表7 miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A預測冠心病、MACE發生的價值

圖1 miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A預測冠心病發生的ROC曲線圖

圖2 miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A預測MACE發生的ROC曲線圖

3 討 論

動脈粥樣硬化是冠心病的發病基礎，其病理機制復雜多樣，多認為與炎癥反應、脂質沉積于血管內膜、內皮細胞受損、單核細胞/巨噬細胞蓄積及增殖等因素相關[11-12]。隨著病人病情加重，血管腔不斷狹窄至阻塞，心肌細胞因缺氧、缺血而出現壞死情況，甚至誘發心源性死亡、嚴重心律失常、病變血管再狹窄等MACE，不利于病人預后[13]。因此，準確評估冠心病病人疾病嚴重程度、尋找早期標志物對于指導治療、預防MACE具有重要意義。

miRNA作為一種易感基因，其能夠通過結合目標mRNA的3′-UTR區來誘導目標mRNA的降解，調節靶基因蛋白以及mRNA表達，進而參與細胞血管的生成、分化以及凋亡。miR-342-5p是miR-342家族成員，其參與了結腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發病過程。Natarelli等[14]研究發現，長期鍛煉的人動脈血管會分泌miR-342-5p并運送至心臟，保護心肌細胞，進而預防心肌梗死發生。Wei等[15]研究報道，miR-342-5p通過抑制Akt1與miR-155依賴途徑而增強巨噬細胞的炎癥刺激，促進動脈粥樣硬化。本研究結果顯示，病例組miR-342-5p高于健康組，MACE組miR-342-5p高于非MACE組，提示miR-342-5p可能參與冠心病的發生、發病過程，可作為預后的評估指標，分析原因可能在于miR-342-5p可促進炎性因子分泌及調控脂質的攝入，其水平升高時可加重炎癥反應及脂質紊亂程度，增加炎性因子的分泌，從而誘發冠心病；miR-342-5p可通過激活機體氧化應激反應，參與核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路的傳導過程，從而誘發心肌缺血再灌注造成的神經損傷；此外，miR-342-5p可通過抑制c-Jun氨基末端激酶2(c-Jun N-terminal kinase，JNK2)及Caspase-9蛋白表達而抑制細胞增殖，加速心肌凋亡，進而導致心肌梗死[16]。炎癥反應在冠心病發病機制中尤為關鍵，而白細胞跨內皮細胞遷移(TEM)是炎癥反應的關鍵。目前，關于TEM參與冠心病發病中的炎癥反應已被證實，但臨床上仍缺少關于其參與動脈粥樣硬化的相關信號通路研究。細絲蛋白-A可介導多種細胞活動，在細胞內信號傳導、腫瘤發生過程中發揮重要作用。國外研究發現，細絲蛋白-A參與炎癥反應中內皮細胞遷移，其過表達可抑制TEM[17]。本研究中，病例組病人血清細絲蛋白-A水平比健康組高，與高貝貝等[18]的研究結果相似。血清細絲蛋白-A與Gensini評分、斑塊穩定性、炎性因子水平均呈正相關，進一步證實血清細絲蛋白-A與冠心病病情、預后有關，但其作用機制需進一步闡明。

LTBP-2作為轉化生長因子-β(TGF-β)的受體，其不僅能夠調節TGF-β表達，穩定細胞外基質，影響成纖維細胞的數量，其還與腫瘤進展、惡性程度、腫瘤分期、腫瘤直徑等病理特征參數密切相關[19]。但目前關于LTBP-2在心血管疾病中的研究報道較少見。白媛媛等[20]研究顯示，轉化生長因子-β1(TGF-β1)可經磷脂酰肌醇激酶(PI3K)及細胞外調節蛋白激酶(ERK)信號通路提升心肌細胞中LTBP-2表達，且LTBP-2診斷心力衰竭的作用與N-末端腦鈉肽前體相似。本研究發現，LTBP-2表達與冠心病發生、炎癥反應、斑塊穩定性及預后有關，可能原因與LTBP-2通過影響心肌重構、心肌纖維化等因素而導致病情進展相關。ROC曲線分析發現，miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A預測冠心病病人MACE發生的AUC分別為0.772，0.821，0.754，最佳截斷值分別為0.31、22.02 μg/L、53.95 ng/mL，而三者聯合檢測的AUC最高，為0.882，說明miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A三者聯合可有效評估冠心病病人預后，降低漏診率。

綜上所述，miR-342-5p、LTBP-2、細絲蛋白-A在冠心病中呈高表達，與病人病情嚴重程度、斑塊穩定性及炎癥反應密切相關，且三者聯合有助于預測冠心病及MACE的發生。