瓣膜性心臟病繼發(fā)心房顫動病人TGF-β1/JNK-MAPK及ERK-MAPK信號通路蛋白表達與T淋巴細胞亞型的相關性

楊 龍，劉春明，王正飛，崔 聰

瓣膜性心臟病屬于我國常見心臟病類型之一，以風濕熱引起的瓣膜損害最常見，可引起各瓣膜的單獨和(或)聯(lián)合損害，也是導致心力衰竭的主要病因[1]。流行病學數(shù)據(jù)顯示，瓣膜性心臟病繼發(fā)心房顫動的發(fā)生率較高，為30%～65%，在心房顫動的發(fā)生原因中瓣膜性心臟病占15%～43%[2]。心房結構重構和心房間質纖維化是心房顫動發(fā)生的重要病理機制[3]。轉化生長因子-β1(TGF-β1)是最強效致纖維化因子，也是最強的細胞外基質沉積促進劑，其信號通路包括經(jīng)典Smads系統(tǒng)和非Smads系統(tǒng)兩種，且各型Smad分子之間相互協(xié)調，在心房顫動、心房纖維化的發(fā)生與維持中發(fā)揮重要作用[4-5]。TGF-β1能激活下游c-Jun氨基端激酶(JNK)-有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)-MAPK信號通路，進而引起心肌組織的膠原堆積，與心房顫動的發(fā)生和維持存在緊密聯(lián)系[6-7]。此外，細胞免疫在風濕熱/瓣膜性心臟病的發(fā)生以及誘導心房顫動形成過程中也扮演重要角色[8]。活化的T淋巴細胞能通過“分子擬態(tài)”識別臟組織蛋白，在心臟局部和循環(huán)炎性因子的誘導下大量聚集，進而釋放多種活性細胞因子，維持免疫激活和抑制的平衡狀態(tài)[9]。其中，尤以CD4+和CD8+T亞型的淋巴細胞，通過交叉反應識別心肌和瓣膜上的配體蛋白或相關信號通路[10]。雖然T淋巴細胞分泌的TGF-β1在早期胚胎發(fā)育、胞外基質合成、JNK-MAPK和ERK-MAPK信號通路的活化過程具有重要作用，但CD4+和CD8+T亞型淋巴細胞分泌的TGF-β1是否與瓣膜性心臟病繼發(fā)心房顫動的發(fā)病有關聯(lián)尚缺乏相關報道。本研究主要探討心臟組織TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信號通路活化在瓣膜性心臟病繼發(fā)心房顫動發(fā)生中的作用，分析其與T淋巴細胞亞型表達的相關性，以期為該疾病的早期診斷和靶標探索提供相關參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年5月—2020年1月鄭州市第七人民醫(yī)院收治的瓣膜性心臟病病人149例，其中繼發(fā)心房顫動78例，根據(jù)是否繼發(fā)心房顫動分為心房顫動組、無心房顫動組。心房顫動組78例，男43例，女35例；年齡28～58(41.39±7.24)歲；病程1～7(3.23±1.51)年；主動脈瓣置換術32例，二尖瓣置換術20例，三尖瓣置換術18例，二尖瓣聯(lián)合主動脈瓣置換術8例；入院時發(fā)病時間30～120(85.2±16.9)min；心室率120～180(155.6±15.8)次/min。無心房顫動組71例，男43例，女28例；年齡29～61(42.06±7.31)歲；病程1～8(3.31±1.56)年；主動脈瓣置換術26例，二尖瓣置換術22例，三尖瓣置換術15例，二尖瓣聯(lián)合主動脈瓣置換術8例。兩組病人性別、年齡、病程和手術類型比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入、排除標準 納入標準：①年齡>18歲；②符合瓣膜性心臟病和心房顫動的診斷標準；③擬行手術治療，術中取病灶組織，病人可耐受；④術后康復出院，簽署知情同意書，臨床資料完整。排除標準：①其他類型心臟疾病，如冠心病、心力衰竭、主動脈夾層、急性心包炎、先天性心臟病(如法洛四聯(lián)癥)等；②原發(fā)性心房顫動，或者不滿足手術指征；③嚴重血液疾病、嚴重肝腎功能障礙、惡性腫瘤、近期大手術、放療、化療；④嚴重感染、自身免疫性疾病。

1.3 研究方法

1.3.1 標本采集 術中取右房壁組織(組織量控制在100 mg)，將脂肪組織去除后置于液氮中，并放置在-80 ℃冰箱中備用，提取蛋白；術中取右房內血液約5 mL進行抗凝血處理，用于T淋巴細胞檢測。

1.3.2 主要儀器與設備 蛋白電泳儀、轉膜槽、蛋白電泳槽購自美國Bio-Rad公司，酶標儀購自美國Bio-Rad公司，Image-Pro Plus 圖像分析軟件購自美國Media Cybernetics公司。

1.3.3 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測方法 采用Western Blot法測定JNK、ERK、磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化ERK(p-ERK)和TGF-β1蛋白水平。常規(guī)方法制備分離膠和10%濃縮膠，取一定量蛋白樣品，與等體積2×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液充分緩和，100 ℃變性5 min，根據(jù)電泳每道50～100 μg加到聚丙烯酰胺凝膠中，設定電壓60 V使蛋白脫離濃縮膠，120 V電泳至溴酚藍達到凝膠底層。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電轉液，并轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，室溫下采用5%脫脂牛奶封閉2 h；向溶液中加入各目標蛋白一抗(稀釋濃度為1∶200，美國Sigma公司)培養(yǎng)過夜，加入對應蛋白二抗，連續(xù)孵育2 h。采用增強化學發(fā)光檢測試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)進行可視化印跡，Tanon 5200儀器曝光；將最終處理的PVDF膜根據(jù)正確位置、方法放置在發(fā)光板上，加入少許發(fā)光液，選擇合適曝光條件，完成顯影和保存。

1.3.4 流式細胞儀測定 采用流式細胞儀(賽默飛Attune NxT)測定右房血液中T淋巴細胞亞型(包括CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平)，參照儀器和試劑說明書進行。

2 結 果

2.1 兩組TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信號通路蛋白表達比較 心房顫動組心肌組織p-JNK、p-ERK和TGF-β1蛋白水平均明顯高于無心房顫動組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，兩組JNK和ERK蛋白水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖1。

與無心房顫動組比較，＊P<0.01。圖1 兩組TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信號通路蛋白表達比較 (A為兩組相關蛋白表達電泳圖；B為兩組相關蛋白表達柱狀圖)

2.2 兩組T淋巴細胞亞型表達比較 心房顫動組右房血液中CD4+和CD4+/CD8+T細胞水平低于無心房顫動組(P<0.05)，但兩組CD8+T細胞水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 兩組T淋巴細胞亞型表達比較(±s)

2.3 兩組TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK蛋白與T淋巴細胞亞型的相關性 Pearson相關分析結果表明，右房心肌組織p-JNK、p-ERK和TGF-β1蛋白水平與右房血液CD4+/CD8+T細胞水平呈負相關(r值分別為-0.439，-0.453和-0.693，P均<0.001)。

3 討 論

研究表明，心房結構重構所致的心房顫動常伴有心房間質纖維化形成，而心房間質纖維化的不可逆改變將會增加瓣膜性心臟病的發(fā)生率，亦是心房顫動發(fā)生中不可或缺的因素[11]。對于瓣膜性心臟病病人常伴有心房肌結構的重構，能影響心房局部興奮或沖動的傳導，改變心房電活動并降低傳導速度，促進折返環(huán)的產生與維持[12-13]。

本研究探討瓣膜性心臟病繼發(fā)心房顫動發(fā)生與心房肌組織TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信號通路激活的關系，發(fā)現(xiàn)心房顫動組心肌組織p-JNK、p-ERK和TGF-β1蛋白水平均明顯高于無心房顫動組(P<0.01)，說明TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信號通路在瓣膜性心臟病繼發(fā)心房顫動病人中表達升高，能促進心臟纖維化的發(fā)生。TGF-β1是一種強效致纖維化因子，主要由細胞分泌產生，亦是臨床發(fā)現(xiàn)最強的細胞外基質沉積促進劑。研究表明，TGF-β1始動與觸發(fā)心房顫動能引起左心房壓力增高，引起心房牽張，并進一步刺激TGF-β1過表達，加劇心房局部纖維化，從而促進瓣膜性心臟病以及繼發(fā)心房顫動的發(fā)生[14]。既往研究表明，TGF-β1主要存在兩種信號通路，以轉化生長因子-β(TGF-β)/Smads為主，具有良好的生物學作用，亦可與其他信號轉導分子相互作用，激活相關蛋白，發(fā)揮重要的致纖維化作用[15-17]。

本研究結果顯示，心房顫動組右房血液中CD4+和CD4+/CD8+水平低于無心房顫動組(P<0.05)。說明瓣膜性心臟病繼發(fā)心房顫動病人常伴有T淋巴細胞亞型表達異常，尤其是CD4+/CD8+，可能與TGF-β1調節(jié)有關，但是具體機制并未闡明。研究表明，T淋巴細胞是維持風濕熱后瓣膜心臟病持續(xù)損害的主要參與者之一，T淋巴細胞能夠識別致病鏈球菌M蛋白和心臟組織自身抗原，發(fā)揮自身免疫反應，引起瓣膜組織損傷，亦可分泌多種細胞因子進一步發(fā)揮生物學作用[18]。T淋巴細胞除了正常分泌Th1、Th2類細胞因子外，亦可分泌TGF-β1。TGF-β1是一類多肽信號分子，在人體中主要由淋巴細胞、心肌細胞、巨噬細胞等分泌，能介導細胞增殖與凋亡，調節(jié)細胞外基質作用[19]。激活的T細胞能合成和分泌TGF-β1，作為效應細胞因子。MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，包括ERK、JNK和p38，對胞外刺激具有有絲分裂原、胞內應激反應等功能。MAPK在瓣膜性心臟病中能調節(jié)多種功能基因表達，影響炎癥反應、T淋巴細胞介導的細胞免疫等生理和病理過程。

Pearson相關分析顯示，p-JNK、p-ERK和TGF-β1蛋白水平與CD4+/CD8+水平呈負相關(P<0.001)。說明瓣膜性心臟病繼發(fā)心房顫動病人中TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信號通路與T淋巴細胞之間存在緊密聯(lián)系，加強病人TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信號通路和T細胞免疫功能檢查，有利于指導臨床治療[20]。

綜上所述，TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信號通路激活可能參與了瓣膜性心臟病繼發(fā)心房顫動的發(fā)生機制，并與局部血液中CD4+/CD8+T淋巴細胞水平降低有關。研究不足是未設立陰性對照組，不能說明TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信號通路異常激活是否在瓣膜性心臟病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用；未對心房顫動類型進一步區(qū)分比較，不能說明TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信號通路異常激活與不同類型心房顫動(陣發(fā)性、持續(xù)性以及永久性)間的差異性；也未對手術治療心房顫動后的結局進行描述(恢復竇性心律)，TGF-β1/JNK-MAPK以及ERK-MAPK信號通路是否恢復竇性心律有關。因此，后續(xù)研究應著重關注這些因素。