血清趨化因子12基因多態性與缺血性腦卒中的關系

劉小霞，張彥偉，岳 毅，劉少凱，王春暉，張彥清

腦梗死又稱缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)，是指腦部血液循環障礙導致的腦組織壞死，占所有腦卒中病人的75%～80%，是我國成年人群死亡、嚴重致殘的重要原因之一。缺血性腦卒中分布具有明顯的年齡、性別、地域、城鄉差異[1]。缺血性腦卒中的發生除與高血壓、糖尿病、血脂異常、心臟病、吸煙、飲酒以及肥胖等可改變的危險因素相關外[2-5]，也與遺傳因素相關[6-10]。血清趨化因子 12 (chemokine C-X-C motif-ligand-12，CXCL12)可表達于腦血管內皮細胞，在血管重塑與血管再生過程中發揮重要作用[11]。此外，CXCL12在動脈粥樣硬化病變中表達，對血管重塑和新內膜形成具有重要意義[12-13]。研究表明，血漿中高水平 CXCL12 可能與缺血性腦卒中發生的風險升高密切相關[14-15]。有研究表明，部分CXCL12基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能與CXCL12的血漿水平密切相關[16]，且與缺血性腦卒中的發生風險增加有關，但結果頗有爭議[17-18]。目前，CXCL12基因多態性與缺血性腦卒中的研究相對較少。本研究擬通過病例-對照研究，根據既往陽性結果及查閱文獻，篩選CXCL12基因SNP rs501120，探討其基因型、等位基因與老年缺血性腦卒中病理特征的關系，為臨床從基因遺傳水平深入了解缺血性腦卒中發病機制、疾病的診治和預防等提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月—2019年12月山西醫科大學第一醫院神經內科收治的缺血性腦卒中病人160例為病例組，男93例，女67例；年齡(72.70±9.42)歲。納入標準：①符合全國第四屆腦血管病學術會議修訂的缺血性腦卒中的診斷標準；②經頭顱磁共振成像(MRI)或頭顱CT確診；③漢族，年齡>65歲。排除標準：①出血性梗死；②其他病因學亞型；③其他合并腦外傷、血液系統疾病、動脈瘤、惡性腫瘤的病人。從同期山西醫科大學第一醫院體檢中心選取233名年齡和性別相匹配的健康對照者為對照組，男131名，女102名；年齡(72.55±5.97)歲；經頭顱CT、MRI排除心腦血管疾病病史。本研究通過山西醫科大學第一醫院倫理委員會審查(編號：〔2020〕-K010)，且入選對象均自愿簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 用調查問卷形式收集一般資料，包括性別、年齡、身高、體重、高血壓病史、糖尿病病史、高脂血癥、冠心病病史、吸煙史、飲酒史等。

1.2.2 DNA提取 采集所有研究對象清晨空腹靜脈血5 mL，加入2%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，-20 ℃冰箱保存備用，取出樣本并在室溫條件下解凍，應用標準方案使用全基因組DNA試劑盒(太原市萊博瑞生物科技有限公司)按說明書提取DNA，將提取的DNA保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 聚合酶鏈式反應(PCR) 通過文獻查閱及美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫搜索，篩選 CXCL12基因 SNP 位點rs501120。采用Premier 5.0進行引物設計(武漢君諾德公司)，引物序列：正向引物為5′ -CAGCAAAGACGGAGGAG-3′，反向引物為5′-GCATGTGAACCTACAACTC-3′。基因分型采用PCR，首先進行PCR擴增，PCR總反應體系為10 μL：基因組DNA 1 μL，2xTap PCR Master mix，正向引物設1 μL，反向引物設1 μL，雙蒸水(ddH2O)6 μL。PCR擴增條件：預變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，擴增30個循環后，終末延伸72 ℃ 7 min。電泳檢測：取擴增物5 μL，予以3%的瓊脂凝膠電泳，使用限制性內切酶2 U消化擴增產物，然后37 ℃孵育過夜，以含溴化乙啶的 3% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產物。

2 結 果

2.1 病例組和對照組一般資料比較 病例組和對照組在性別、年齡、體質指數(BMI)方面比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。病例組高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠心病、吸煙史、飲酒史比例均明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 病例組和對照組一般資料比較

2.2 基因多態性與缺血性腦卒中的關系 病例組和對照組rs501120位點的基因頻率分布均遵循Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)，具有人群代表性。兩組rs501120 CT、TT基因頻率、T等位基因頻率分布差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2、表3。

表2 兩組rs501120基因型頻率比較 單位：例(%)

表3 兩組等位基因頻率比較 單位：例(%)

2.3 缺血性腦卒中相關危險因素的Logistic回歸分析 Logistic回歸分析顯示，在調整性別、年齡、吸煙、飲酒、冠心病、高脂血癥、吸煙史和飲酒史后，rs501120位點TT基因型是缺血性腦卒中的獨立危險因素(P<0.05)；男性、高血壓、高脂血癥、冠心病、吸煙史、飲酒史均是缺血性腦卒中的獨立影響因素(P<0.05)。詳見表4。

表4 缺血性腦卒中相關危險因素的Logistic回歸分析

2.4 CXCL12基因rs501120與缺血性腦卒中傳統危險因素的交互作用 將Logistic回歸分析中P<0.05的變量與樣本資料導入MDR軟件，制作1～3階不同交互作用情況下的模型。結果顯示，3階交互模型rs501120多態性、高血壓、吸煙史具有最好的平均檢驗準確度(0.682 6)，因此，選擇此模型作為最佳模型(見表5)。

表5 CXCL12基因rs501120多態性與傳統危險因素基于1～3階交互作用分析

3 討 論

本研究結果顯示，病例組與對照組rs501120 TT基因型、T等位基因頻率分布差異均有統計學意義(P<0.05)，提示攜帶rs501120TT基因型與缺血性腦卒中風險增高相關。研究表明，CXCL12作為一種趨化因子，與動脈粥樣硬化的發生密切相關[12-13]，血清CXCL12蛋白水平受rs501120位點的調控[16]。本研究發現，rs501120與缺血性腦卒中的發生風險相關。目前，關于CXCL12基因 rs501120多態性與老年缺血性腦卒中的關聯性研究在我國人群中報道較少。GWAS研究表明位于10q11.21染色體上的關鍵基因rs501120與冠心病的發生風險相關[19-21]。Samani等[22]進行了冠心病的GWAS研究，結果顯示SNP rs501120的T等位基因與冠心病風險增加之間存在關聯，隨后的大規模研究也驗證了CXCL12 rs501120與冠心病有關[23]。Kiechl等[16]研究發現，rs501120 T等位基因與血漿CXCL12水平降低和頸動脈內膜中層厚度增加，可作為動脈粥樣硬化的早期標志物以及心血管疾病風險的預測因子。Xie等[24]研究發現，CXCL12 rs501120多態性與冠狀動脈粥樣硬化的關聯性僅限于女性。Zhu 等[17]研究表明，我國北方漢族人群中CXCL12 rs501120與缺血性中腦卒有關。然而Roder等[18]研究表明，rs501120并不會增加歐洲兒童患煙霧病的風險。這些有爭議的發現可能是研究人群的不同而導致的。本研究發現，rs501120與老年缺血性腦卒中的風險增加有關，即使在調整了缺血性腦卒中的傳統影響因素等混雜因素后，CXCL12 rs501120仍與缺血性腦卒中風險增加有關。

此外，本研究還對CXCL12 rs501120與缺血性腦卒中的傳統危險因素進行了交互作用的分析。結果表明，rs501120與高血壓病史、吸煙史2個因素存在交互作用，三者之間的交互作用可能與缺血性腦卒中風險增加有關，差異有統計學意義(P<0.001)。目前關于CXCL12 基因多態性的研究大多與冠狀動脈粥樣硬化、胃癌、乳腺癌及結腸癌等相關，但與缺血性腦卒中的研究較少。

本研究也存在一定的局限性。首先，樣本量較小，應在大型隊列中進一步研究；其次，只針對CXCL12基因的1個SNP位點以及高血壓病史、糖尿病病史、冠心病病史、吸煙史、飲酒史等危險因素進行分析，在以后的研究中可考慮納入更多的SNP。本研究結果表明，CXCL12基因 rs501120可能是我國漢族老年人缺血性腦卒中發病的易感基因，但關于rs501120影響缺血性腦卒中的病理生理學機制還需進一步研究。