肺腺癌患者代謝相關基因和免疫相關預后模型的建立①

鄧彪 陳春源 黃裕鋒 陳心銘 羅連響 梁柱（廣東醫科大學附屬醫院心胸外科，湛江 524001）

肺癌是全世界癌癥相關死亡的主要原因之一，盡管近年肺癌病死率有所下降，但2017年導致的死亡病例數仍多于乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌和顱內腫瘤死亡病例總和［1］。肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是非小細胞肺癌最普遍的組織類型，與其他肺癌亞型相比，LUAD與基因組變化關系密切，具有高度異質性［2-3］。半數以上LUAD診斷時已是局部晚期或已轉移，預后較差，五年生存率較低，開發一個更有效的LUAD預后預測工具迫在眉睫［4-5］。癌細胞新陳代謝是癌癥的標志之一，可維持癌細胞生長［6］。近年研究表明癌細胞新陳代謝改變對癌癥生長和發展起重要作用，如LUAD預后與癌細胞新陳代謝密切相關［7-10］。因此，系統研究代謝相關基 因（metabolism related genes，MRGs）對 改 善LUAD治療和預后至關重要［11-12］。腫瘤免疫微環境（tumor immune microenvironment，TIME）中的免疫細胞通過分泌代謝決定因子維持腫瘤生長，其類型和豐度對腫瘤進展和免疫治療具有顯著影響［13-14］。但系統分析MRGs、LUAD預后與TIME關系的研究較少。本研究旨在建立基于MRGs的LUAD預測模型，并分析LUAD患者TIME與MRGs的關系，通過生物信息學綜合分析方法研究TCGA（The Cancer Genome Atlas）和GEO（Gene Expression Omnibus）數據庫的LUAD基因表達數據和臨床信息，建立一個性能穩定的風險預測模型和列線圖，通過GO和KEGG功能富集分析探索與模型MRGs密切相關的通路，采用免疫評分相關性分析探索高低風險患者免疫細胞和免疫相關通路差異，探討MRGs與TIME的關系。

1 資料與方法

1.1樣本基因組表達數據和臨床信息研究流程如圖1所示。從TCGA數據庫（https：//ancergenome.nih.gov/）在線下載LUAD患者訓練組轉錄數據和臨床數據（轉錄組數據共551個樣本，56 753個基因，其中腫瘤樣本497例，癌旁樣本54例；臨床數據共522個樣本，包含生存時間、生存狀態、年齡、性別、分期和T、N、M分期等臨床信息），從GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）在線下載包括患者臨床信息和基因表達的芯片數據GSE31210，包括246個早期LUAD樣本的54 675個基因，其中226個樣本包含生存時間、生存狀態、年齡、性別、分期和吸煙史等在內的完整臨床信息。納入本研究的LUAD患者臨床數據如表1所示。從分子簽名數據庫（http：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）下載959個MRGs［15-16］，篩選生存時間＞30 d的樣本進行生存分析。

表1 納入本研究的LUAD患者臨床特征［例（%）］Tab.1 Clinical characteristics of LUAD patients included in this study［n（%）］

圖1 研究流程圖Fig.1 Flow chart

1.2MRGs表達矩陣提取將從TCGA下載的LUAD表達數據去除在所有樣本中均呈低表達的基因（在所有樣本的平均表達＜0）并進行標準化處理，與從分子簽名數據庫下載的959個MRGs取交集，提取出949個交集MRGs的表達數據。

1.3篩選預后相關差異MRGs將TCGA訓練隊列的腫瘤組織和正常組織分類，通過R語言“limma”包在提取出交集MRGs的表達數據中進行基因差異表達分析，以fdrFilter=0.05和logFCfilter=2為篩選界值，得到100個顯著差異表達MRGs，繪制差異MRGs火山圖。將TCGA訓練隊列中結合臨床信息的LUAD患者表達數據進行單因素COX分析得到209個預后相關MRGs，將顯著差異表達的MRGs與預后相關MRGs取交集，得到32個預后相關差異MRGs，以韋恩圖顯示交集過程并繪制交集基因在正常組織和LUAD腫瘤組織中的差異表達熱圖。將GEO隊列的基因表達信息與其臨床信息合并，得到驗證組表達與生存數據，用于模型驗證。所有分析采用R軟件（4.0.3）完成。采用String PPI網絡在線工 具（https：//string-db.org/）分 析 預 后 相 關 差 異MRGs的關系［17］，并輸出蛋白互作網絡圖。

1.4獲取共表達基因將GSE31210樣本得到的246個早期LUAD患者表達數據進行處理，包括去除表達量無效值、轉換ID、去除低表達和去重，得到含246個LUAD樣本的15 255個基因GEO驗證隊列表達數據。將GEO驗證隊列基因與TCGA訓練隊列預后相關差異MRGs取交集，得到19個兩隊列中共表達的MRGs，并分別在TCGA隊列與GEO隊列中提取共表達MRGs的表達矩陣。

1.5MRGs風險模型在TCGA共表達MRGs的表達矩陣中，經Lasso回歸分析計算出各MRGs回歸系數β，篩選出12個建立風險預測模型的最佳候選MRGs，用候選基因表達水平與其回歸系數β乘積之和建立風險預測模型并繪制Lasso模型圖。風險值=基因1表達×β1+基因2表達×β2+…+基因n表達×βn。

1.6預后潛力分析以風險值中位數為界值，分別將TCGA和GEO隊列中LUAD患者分為高風險組和低風險組，Kaplan-Meier（Km）曲線預測高風險組和低風險患者總生存率差異，ROC曲線檢驗風險模型的預后潛力和意義，AUC值評估模型預測效能。本研究采用R語言“Survive”包比較最優基因在LUAD和正常組織中的表達差異。

1.7GO和KEGG富集分析采用R語言的R包“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”和“enrichplot”進行GO和KEGG富集分析，探討不同分子機制及高、低風險患者差異。GO分析包括生物過程、細胞成分和分子功能。

1.8關鍵MRGs表達分析為分析構建模型MRGs表達以進一步驗證上述分析結果，本研究采用HPA（The Human Protein Atlas）在線數據庫（https：//www.proteinatlas.org/）對比TCGA數據庫中癌組織和鄰近正常肺組織的病理切片［18］，驗證這些MRGs在翻譯水平的差異表達情況。

1.9TIME分析不同LUAD患者生存差異可能由TIME的復雜性導致，因此本研究采用單樣本基因集富集分析（ssGSEA）算法分析一些免疫細胞和免疫相關通路在高、低風險患者中的比例。通過采用R語言“GSVA”包和“GSEABase”包對TCGA和GEO隊列中高、低風險樣本進行免疫評分，用“limma”“ggpubr”和“reshape2”包進行免疫評分相關性分析，采用ssGSEA算法進一步量化免疫細胞浸潤水平和免疫相關通路活性，包括16種免疫細胞：aDCs、B細胞、CD8+T細胞、DCs、巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞、pDCs、T輔助細胞、Tfh細胞、Th1細胞、Th2細胞、腫瘤浸潤的淋巴細胞、調節性T細胞、iDCs，13種免疫相關活性通路：APC共抑制、APC共刺激、CCR、檢查點、溶細胞活性、HLA、驗證促進、MHCⅠ、副炎癥、T細胞共抑制、T細胞共刺激、Ⅰ型IFN反應、Ⅱ型IFN反應。

1.10統計學分析采用t檢驗確定腫瘤組織和正常組織差異表達MRGs。采用卡方檢驗比較各組比例構成差異。Mann-Whitney檢驗評估風險組間免疫細胞或途徑ssGSEA得分差異，BH法調整P值。單因素和多因素COX回歸分析確定OS的獨立預后因素。Lasso回歸分析計算候選基因回歸系數β，Km分析和對數秩和檢驗（Log-rank test）比較各組OS，所有統計分析均采用R軟件（4.0.3版本）完成。GSEA分析各通路矯正富集評分（NES）與富集程度（NOM p-val），所有分析均以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1MRGs在LUAD和正常組織樣本存在顯著差異從TCGA中得到所有LUAD患者mRNA表達數據和臨床資料，在分子簽名數據庫（http：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）提取出959個MRGs。將從TCGA下載的LUAD表達數據去除在所有樣本中均呈低表達的基因并進行標準化處理，與959個MRGs取交集，提取出949個交集MRGs表達數據。TCGA訓練隊列中腫瘤組織和正常組織分類后，通過R語言“limma”包在提取出交集MRGs表達數據中進行差異表達分析，以fdrFilter=0.05和logFCfilter=2作為篩選界值，得到100個在腫瘤和正常組織顯著差異表達MRGs，繪制差異MRGs火山圖（圖2A）。在TCGA訓練隊列中結合臨床信息的LUAD患者基因進行單因素COX分析顯示，其中209個與LUAD患者OS相關。將預后相關MRGs與顯著差異表達的MRGs取交集，得到32個與LUAD患者OS相關的差異MRGs（圖2B），韋恩圖顯示32個與預后相關的差異MRGs交集過程，并繪制了交集基因在正常組織和LUAD腫瘤組織中的差異表達熱圖（圖2C），樹狀圖（圖2D）顯示單因素COX分析32個基因的P值和風險比（HR）：16個MRGs為保護基因（HR＜1），16個MRGs為危險基因（HR＞1）。

圖2 MRGs在LUAD和正常組織樣本存在顯著差異Fig.2 MRGs were significantly different between LUAD and normal tissues

2.2基于MRGs的預后模型 對TCGA-LUAD訓練隊列中12個模型基因表達的關系進行評估，采用String PPI網絡在線工具（https：//string-db.org/）繪制蛋白互作網絡圖（圖3A），并制作基因相關性網絡（圖3B），結果顯示32個MRGs存在相互作用。相關性分析表明，FMO2與RRM2、TK1、PFKP呈顯著負相關。將GEO隊列基因表達信息與其臨床信息合并，得到驗證組表達與生存數據，去除表達量無效值、轉換ID、去除低表達和去重等處理后得到15 255個基因，與TCGA中32個預后相關差異MRGs取交集后得到19個共表達基因。在TCGA表達數據中提取訓練組共表達基因表達矩陣。為整合這些關鍵基因作用，并確定對生存結果最重要的基因，在訓練訓練組共表達矩陣中將上述19個基因進行Lasso回歸分析，根據Lasso回歸結果確定12個基因（TK1、GCLC、PFKP、CA9、CEL、CA4、RRM2、CYP2D6、HAL、GSTA3、FMO2和ENO3）構建風險預測模型（圖3C、D），12個基因全名和風險系數見表2。模型風險值=（0.016 789 869 774 756 4×TK1表達量）+（0.011 750 257 755 730 3×GCLC表 達 量）+（0.057 003 517 487 642 8×PFKP表 達 量）+（0.033 715 712 604 503 8×CA9表 達 量）+（-0.122 404 966 481 127×CEL表 達 量）+（-0.060 890 413 642 635 5×CA4表 達 量）+（0.144 614 619 025 540 0×RRM2表 達 量）+（-0.038 521 995 672 867 4×CYP2D6表 達 量）+（0.081 884 526 436 414 1×HAL表 達 量）+（-0.311 751 816 268 740 0×GSTA3表 達 量）+（-0.054 444 453 536 976 8×FMO2表 達 量）+（-0.096 587 758 173 598 2×ENO3表達量）。

圖3 預后模型MRGs篩選Fig.3 Screening of MRGs for prognostic model

表2 預測模型中的基因Tab.2 Genes in prediction model

2.3風險評分與患者預后的關系根據轉錄矩陣中基因表達數據與臨床數據（TCGA隊列中共457個有完整臨床信息的樣本被納入風險預后分析）計算TCGA訓練集中各LUAD患者風險分數，將風險分數按遞增順序排列（圖4A），以中位數將訓練集中所有患者分為高風險組（n=228）和低風險組（n=229）。

圖4 TCGA-LUAD隊列中12基因預測模型風險評分分析Fig.4 Risk score analysis of 12-gene predictive model in TCGA-LUAD cohort

2.4風險評分是獨立預后指標 為探討風險分數和臨床特征與患者生存的相關性，本研究進行了單因素和多因素COX風險回歸分析，以風險分數、性別、年齡、臨床分期、T、N和M分期為協變量，評估以上指標預測預后的潛力。單因素COX回歸分析（圖6A）結果顯示：臨床分期（HR：1.597；95%CI：1.361～1.873；P＜0.001）、T分期（HR：1.593；95%CI：1.304～1.947；P＜0.001）、N分期（HR：1.959；95%CI：1.101～圖4B顯示了訓練集中457例患者風險評分、OS（以年為單位）和生存狀態，按風險評分遞增順序排列，高風險分數患者病死率高于低風險分數患者。對所有患者進行主成分分析（PCA），PCA圖和t-SNE圖顯示，不同風險組患者被分為兩個方向（圖4C、D）。Km分析顯示高風險組和低風險組患者總體預后差異顯著（Log-ranking檢驗，P＜0.001，圖4E），高風險組患者存活率明顯低于低風險組。12個基因差異表達熱圖（圖4F）顯示，各基因在高低風險組間表達存在差異。ROC曲線評估12個基因在LUAD患者預后預測的有效性顯示：風險評分預測三、四、五年生存率AUC分別為0.726、0.739和0.688（圖5A），對四年生存率預測方面，風險評分AUC明顯高于其他臨床特征AUC（圖5B），提示該模型預測性能良好。將本研究MRGs模型與類似模型進行比較［19-20］，其模型三、四年ROC AUC分別為0.567和0.587（圖5D），三、四、五年ROC AUC分別為0.623、0.696和0.700（圖5E），表明本課題組開發的模型預測性能更穩定。3.486；P＜0.001）、M分 期（HR：1.959；95%CI：1.101～3.486；P=0.022）和風險評分（HR：3.104；95%CI：2.306～4.178；P＜0.001）與患者生存相關，多因素COX回歸分析（圖6B）結果顯示：風險評分（HR：2.676；95%CI：1.964～3.647；P＜0.001）與患者生存相關。風險評分在單因素分析和多因素分析中均具有顯著獨立預后價值（P＜0.001），證明12基因標記對生存具有獨立預測價值。表明基于12基因標記的風險評分對預測LUAD患者預后具有重要意義。基于TCGA-LUAD隊列進一步構建了臨床診療過程中實用性更強的列線圖（圖6C）及其校準曲線（圖6D～F），納入4個預后因素（年齡、性別、分期和風險評分），根據影響生存的預后因素比例對患者進行評分，預測患者一、三、五年生存率，列線圖預測一、三、五年生存的校準曲線與對角線能較好重合，顯示出列線圖較穩定的預測性能。

圖5 ROC曲線驗證風險模型預測生存率的穩定性［19-20］Fig.5 ROC curve verifies stability of risk model predicting survival rate［19-20］

圖6 獨立預后分析與列線圖Fig.6 Independent prognostic analysis and nomogram

2.5風險簽名驗證為進一步探討預測性能，通過GSE31210中226個樣本進行外部驗證，采用上述方法計算GEO驗證集所有LUAD患者風險分數，將風險分數按遞增順序排列（圖7A），以中位數將訓練集中所有患者分為高風險組（n=113）和低風險組（n=113）。圖7B顯示驗證集中226例患者風險評分、OS（以年為單位）和生存狀態，按風險評分遞增順序排列，高風險組有更多死亡患者。所有患者PCA和t-SNE分析顯示，不同風險組患者仍可被較明顯地分為兩個方向（圖7C、D）。Km分析（圖7E）同樣顯示：高風險組和低風險組患者總體預后差異顯著（Log-ranking檢驗，P＜0.05），圖7F差異熱圖顯示GEO驗證組各基因在高低風險組間差異表達。GEO驗證集中風險評分預測五年生存率ROC曲線AUC也達到0.681（圖5C），高于其他臨床特征AUC，驗證了模型的可靠預后性能。

圖7 GEO-LUAD隊列中12基因預測模型風險評分分析Fig.7 Risk score analysis of 12-gene predictive model in GEO-LUAD cohort

2.6通路和功能富集分析 為闡明與風險評分相關的生物學功能和通路，基于TCGA-LUAD隊列高風險組和低風險組差異表達基因，對GO和KEGG途徑進行富集分析，GO分析顯示（圖8A），生物學過程（BP）中，TCGA隊列的風險組間差異表達基因主要富集于小分子分解過程和嘌呤復合物代謝過程，細胞成分（CC）方面，差異表達基因主要富集于線粒體基質轉移酶復合物和含磷基團。分子功能（MF）方面，差異表達基因主要富集于磷酸酯水解酶活性和裂解酶活性。KEGG途徑分析顯示，差異基因在嘌呤代謝、輔因子生物合成及碳代謝等通路顯著富集（圖8B）。

圖8 GO和KEGG富集分析Fig.8 GO and KEGG enrichment analysis

2.7TIME為進一步討論高風險人群和低風險人群TIME差異，評估了免疫細胞和免疫相關功能通路得分。TCGA隊列高風險組中，NK細胞、Th1細胞、Th2細胞的免疫細胞亞群顯著上調（調整后P＜0.05）；B細胞、肥大細胞、中性粒細胞、T輔助細胞、iDCs的免疫細胞亞群顯著下調（調整后P＜0.05，圖9A）。免疫相關通路方面，APC共刺激、炎癥加劇、Ⅰ型主要組織相容性復合體和副炎癥顯著上調（校正P＜0.05），人類白細胞抗原和Ⅱ型IFN反應顯著下調（校正P＜0.05，圖9B）。通過GSE31210隊列高風險組驗證，巨噬細胞、Th2細胞、Treg及檢查點、副炎癥、T細胞共刺激、Ⅰ型IFN反應等免疫功能上調，肥大細胞、iDCs細胞和Ⅱ型IFN反應下調（P＜0.05，圖9C、D）。

2.8MRGs在翻譯水平的差異HPA數據庫中免疫組化結果顯示：CA4在腫瘤組織中表達的蛋白被中度染色，CA9、PFKP在腫瘤組織中表達的蛋白被重度染色，RRM2在腫瘤組織中表達的蛋白也被輕度染色，而4個基因在正常肺組織中均未找到被染色的相應蛋白（圖10）。

3 討論

近年高通量技術和生物信息學方法迅速發展，差異基因和基于特定通路的基因簽名在預測LUAD預后中的研究與日俱增，MRGs與癌癥預后關系的研究備受關注［21-25］。LUAD是非小細胞肺癌最常見亞型，具有顯著預后差異［11-12，26］。精準預測LUAD生存率使開發穩定的預后指標極為重要。本研究揭示了MRGs在LUAD中的作用及臨床意義，驗證了12個MRGs與LUAD發生發展的密切關系，構建了一個新的MRGs預后模型，討論了該模型作為臨床預測指標的價值。

本研究從TCGA-LUAD數據集共檢測到100個差異表達MRGs，通過LUAD單因素COX回歸分析，發現了32個與OS顯著相關的MRGs。Lasso回歸分析后建立了一個由12個MRGs（TK1、GCLC、PFKP、

CA9、CEL、CA4、RRM2、CYP2D6、HAL、GSTA3、FMO2和ENO3）組成的新的預后標志。根據預后標志的風險評分將LUAD患者分為高風險組和低風險組，高風險組患者OS明顯低于低風險組。隨時間變化的ROC分析顯示，一、三、五年的AUC分別為0.726、0.739和0.688，提示此預后標志具有良好的敏感性和特異性。進一步分析表明，調整到其他臨床因素后，風險評分是獨立的預后指標。該標志的預測價值在GSE31210數據集中得到了驗證。為更好地預測LUAD患者OS，將風險評分與臨床特征相結合，建立了預測LUAD患者一、三、五年生存率的列線圖。此外，預后列線圖校準曲線顯示，各OS的預測存活率和觀察存活率間有較好的一致性。

GO和KEGG富集分析表明，風險評分改變主要與小分子分解過程、嘌呤復合物代謝過程、線粒體基質轉移酶復合物、磷酸酯水解酶活性、輔因子生物合成等通路有關。已有證據表明嘌呤類化合物可通過與katanin相互作用誘導微管斷裂和肺癌細胞死亡［27］；而另一方面也有研究指出腺嘌呤合成代謝可決定腫瘤干細胞樣特性和吉非替尼耐藥性產生［28］。輔酶代謝上調的代謝表達亞型與腫瘤預后較差相關，如被K63-多泛素化后的輔酶DDX17可通過對miRNA合成和組蛋白修飾的調控作用控制腫瘤干細胞樣特征［29-30］。

基于MRGs的預后模型可用于評估潛在的臨床結局和免疫細胞浸潤。風險評分和免疫評分相關性分析表明，高風險組中NK細胞、Th1細胞、Th2細胞的免疫細胞亞群顯著上調；B細胞、肥大細胞、中性粒細胞、T輔助細胞、iDCs免疫細胞亞群顯著下調。Th2細胞、肥大細胞和iDCs在GSE84426隊列中得到了驗證。至于免疫相關通路，APC共刺激、炎癥加劇、Ⅰ型主要組織相容性復合體和副炎癥顯著上調，人類白細胞抗原和Ⅱ型IFN反應顯著下調，副炎癥和Ⅱ型IFN反應在GSE84426隊列中得到了驗證。

免疫微環境會影響腫瘤發展、侵襲和轉移，不同免疫細胞浸潤程度往往提示不同預后［31］。已知預后較差的LUAD患者NK細胞、Th1細胞、Th2細胞、巨噬細胞、Treg往往顯著上調，與本研究免疫細胞浸潤程度差異分析結果相符，且巨噬細胞、Th2細胞、Treg上調在GEO中得到了驗證，因此高風險組預后較低風險組預后差［20，32-34］。相關研究表明：活化的NK細胞可用于抗腫瘤治療，并控制腫瘤生長和轉移擴散，但腫瘤微環境含有的活性氧可抑制NK細胞抗腫瘤活性，可能導致腫瘤中巨噬細胞和NK細胞百分比往往低于正常肺組織［32，35-36］。但LUAD高風險組中，巨噬細胞和NK細胞更高的浸潤程度卻提示更差的預后。巨噬細胞根據功能活性可分為M1型和M2型，不同LUAD中兩種亞型巨噬細胞數量與分布差異顯著，導致LUAD患者不同預后，研究表明，通常位于腫瘤細胞池的M1巨噬細胞與較好的預后相關，而在腫瘤間質中更為豐富的M2巨噬細胞與較差預后相關［20］。Treg通過上調抑制腫瘤相關第三級淋巴樣結構中的抗腫瘤反應，導致更差預后［37］。肺癌復發患者中，Th2浸潤程度顯著上升，Th1/Th2降低。高水平的2型細胞因子（如IL-10）有助于腫瘤細胞逃脫免疫監視，或許解釋了Th2浸潤水平上調LUAD患者往往預后不良［37］。

免疫相關途徑方面，APC共刺激、炎癥加劇、Ⅰ型主要組織相容性復合物和副炎癥途徑顯著上調。副炎癥上調和Ⅱ型IFN反應下調可能與LUAD更好預后有關，在TCGA與GEO兩個隊列中均得到了證實：高風險組患者副炎癥途徑上調而Ⅱ型IFN途徑下調。程序性定向死亡-1（PD-1-directed）免疫檢查點阻斷可在多種晚期惡性腫瘤中產生持久抗腫瘤活性［38］；Ⅱ型IFN是癌癥和宿主細胞中PD-L1表達的關鍵驅動因素［39］；Ⅱ型IFN反應發生有利于抗腫瘤活性增強，Ⅱ型IFN減少將抑制腫瘤細胞程序性死亡，因此Ⅱ型IFN途徑下調預示不良預后。

此外，12個基因（TK1、GCLC、PFKP、CA9、RRM2、HAL、CEL、CA4、CYP2D6、GSTA3、FMO2和ENO3）被確定為關鍵預后基因，并可根據單因素COX分析HR和Lasso模型Coef值確定TK1、GCLC、PFKP、CA9、RRM2和HAL這6個基因為危險基因，均在高風險LUAD樣本中高表達，與風險評分和不良預后呈正相關。而CEL、CA4、CYP2D6、GSTA3、FMO2和ENO3這6個基因被認定為保護基因，其高表達可降低風險評分，與LUAD患者不良預后呈負相關。RRM2是核糖核苷酸還原酶催化亞基，可調節酶活性，在DNA復制和修復中起重要作用，并與細胞周期、p53信號傳導途徑、細胞凋亡等通路相關。RRM2可獨立預測LUAD預后，并與免疫浸潤有關，與B細胞標志基因的緊密關系是免疫應答的潛在中心［40］。相關研究表明：RRM2過表達促進了Bcl-2和E-鈣黏蛋白信號通路激活，并抑制p53信號通路激活，促進LUAD細胞增殖和侵襲［41］。多種途徑（包括糖代謝途徑）可能參與PFKP調控。有研究從抑制PFKP表達角度證明：PFKP表達降低的肺癌細胞系中葡萄糖攝取率、乳酸水平和三磷酸腺苷濃度顯著降低，可能導致增殖速率、集落形成能力顯著降低和G2/M周期細胞百分比提高［42］。表明PFKP可能是LUAD的促癌基因。CA4編碼的蛋白是12種人活性同工酶之一，表達于毛細血管床、腎臟壁膜、肺微血管和脈絡膜毛細血管。已有研究證明CA4低表達可促進癌細胞增殖，與本研究結論相同［43］。通過慢病毒介導技術建立CA4過表達細胞系證明：CA4過表達后，細胞增殖能力顯著下降，由此得出結論，CA4可能是抑癌基因，可能與CA4抑制G1期細胞增殖，誘導細胞凋亡有關［44］。與同為碳酸酐酶家族的CA4不同，較少有實驗闡述CA9在LUAD中的致癌機制，一項對惡性間皮瘤研究發現，CA9被特異性抑制劑抑制或在低氧條件下被敲低會阻礙腫瘤細胞增殖和遷移，最終導致腫瘤細胞死亡，證明CA9與腫瘤不良預后相關，與本研究結論一致［45］。表明CA9可能是包括肺癌、惡性間皮瘤等在內的多種腫瘤致癌基因。

本研究也存在一定局限性。首先，本研究從公共數據庫中獲得了LUAD患者相應資料，無法排除轉錄本可能存在的選擇偏倚。其次，對模型基因功能的驗證需要更多實驗支持。另外，預測模型的穩定性需在大型前瞻性研究中得到驗證。

總之，本研究根據TCGA和GEO數據庫篩選出的12個MRGs是LUAD患者生存率、TIME的潛在預測指標。基于12個MRGs構建的預測模型是與OS相關的獨立預測因素，模型評分越高，預后越差。基于該模型，進一步開發了一個方便臨床醫師預測LUAD患者一、三、五年生存率的列線圖，具有良好預測性能。此外，本研究還為LUAD腫瘤微環境中免疫細胞浸潤研究提供了新的見解，有助于實現精準診斷與治療。