濃香型白酒上下層原酒風味特征及影響因子分析

尹倩倩，劉雙平,3，秦輝，韓笑,3，劉海坡，張宿義，沈才洪，毛健,3*

1(江南大學 食品學院，糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(紹興)產業技術研究院，浙江 紹興，312000)3(國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興，312000)4(瀘州老窖集團有限公司，四川 瀘州，646000)5(中國酒業協會，北京，100089)

濃香型白酒是我國著名白酒，歷史悠久，具有獨特的風味和香氣，年產量占中國白酒的70%以上[1-2]。濃香白酒的工藝特點是采用固態泥窖發酵法釀制，在發酵生產上依賴于高粱、大曲等原材料在窖池中的無氧發酵，其中霉菌、酵母和細菌在內的微生物群參與了風味物質的合成[3]。但由于窖內不同層糟醅所處空間位置不同，因而微生態環境不同，微生物的生長代謝狀態存在差異，在釀造過程中產生微生物代謝物質差異[4]，最終導致不同層糟醅所產酒的酒質不同。生產實踐證明，窖池的上層糟醅所產酒酒質明顯低于下層，如何提高上層糟醅原酒酒質，是釀酒行業亟待解決的問題，也是提高企業優質酒產量最為經濟、高效的途徑。

白酒中風味物質主要包括有機酸、酯類、醇類、醛類及其他芳香族化合物和雜環類化合物，根據風味化合物的種類和含量可以確定不同類型白酒的風味特征[5]。濃香型白酒的特征風味化合物包括己酸、丁酸、乙酸和乳酸及其相應的乙酯，其中己酸乙酯和己酸對其典型風味貢獻最大[6-8]。有報道[9-11]稱濃香型糟醅的主要香氣成分酯類和酸類含量均呈現下層>中層≥上層的分布規律，且丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、己酸、丁酸等典型風味物質在下層糟醅中的含量均明顯高于上層；此外，段明松等[12]采用頂空-固相微萃取-氣質聯用法(headspace-solid-phase microextraction-GC/MS, HS-SPME-GC/MS)對不同空間位置的濃香原酒香氣成分進行了分析，結果表明下層原酒中風味物質總量最高，其中酯類物質總量、正己醇、異戊醇、正丁醇和己酸等主要風味物質含量均高于中層和上層原酒；沈才萍等[4]和馮海燕等[13]研究表明，下層原酒風味成分含量較高，口感最為豐富，其中有機酸、丁酸乙酯、己酸乙酯含量明顯高于上層原酒。綜上，濃香型白酒生產中不同層原酒風味差異已明晰，然而對于造成這種風味差異的原因尚不明確，相關研究亟待分析。

本研究采用HS-SPME-GC/MS研究了上下層原酒風味特征，并利用正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis, OPLS-DA)模型確定引起上下層原酒差異的主要風味物質，進而通過Spearman相關性分析，結合糟醅相關指標探究了引起原酒差異的主要因素，最后研究了氧氣和黃水對原酒風味物質的影響。本研究以期為濃香型白酒生產工藝改進提供借鑒，為提升優質原酒產量提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品

糟醅、原酒和黃水由四川某白酒企業提供。隨機選擇三口正常發酵采用泥封封窖的窖池，在發酵結束后用取樣器對上層和下層糟醅進行取樣，并對對應糟醅樣品蒸餾的原酒和發酵結束后的黃水進行取樣。

1.1.2 培養基

EG培養基(用于絕對厭氧菌篩選)、LB培養基(用于細菌篩選培養)、PDA培養基(用于真菌篩選培養)、MRS培養基(用于乳酸菌的特性研究)、RCM培養基(用于厭氧菌特性研究)、YPD培養基(用于酵母特性研究)均購自青島海博生物技術有限公司。

高粱培養液[9]：稱取200 g高粱(粉碎)于燒杯中，用適量蒸餾水潤濕后蒸熟，加入300 mL蒸餾水，加入0.2 mL α-淀粉酶和0.2 mL糖化酶，60 ℃液化糖化2 h，離心過濾取上清液，121 ℃滅菌20 min。用于研究黃水濃度對分離微生物的影響。

1.2 儀器與設備

DF-101 KS恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州恒巖儀器有限公司；固相萃取裝置，上海安譜公司；Thermo Fisher TRACE 1300氣相色譜-質譜聯用儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；FE 20 pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；CY-12 C便攜式測氧儀，杭州艾普儀器設備有限公司；SW-CJ-1 CCV超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；AW 200 SG厭氧工作站，瑞士康科技有限公司；KC/HWS-250 PY恒溫恒濕培養箱，上海凱測實驗設備有限公司；GZX-9146 MBE電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司；HYL-C 3組合式搖床，蘇州太倉市強樂實驗設備有限公司；SynergyH 1全功能酶標儀，美國Bio-RAD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原酒風味物質測定

吸取5 mL稀釋20倍的原酒至20 mL頂空固相微萃取瓶中，加1.5 g氯化鈉和20 μL 2-辛醇內標，混勻，45 ℃萃取50 min[14]。氣相進樣口溫度為250 ℃，載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min。升溫程序：初始溫度40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至150 ℃，保持2 min；再以6 ℃/min升至230 ℃并保持5 min。質譜條件：電離模式為電子轟擊離子源，70 eV；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質量掃描范圍35～350 aum。

1.3.2 糟醅相關指標測定

糟醅水分含量、酸度、pH、還原糖、淀粉含量[15]和氧氣含量：水分測定采用烘干法；酸度采用酸堿滴定法；pH采用pH計直接測定；淀粉和還原糖含量采用斐林試劑法測定；發酵前期糟醅氧氣含量利用便攜式測氧儀測定。

糟醅有機酸測定：糟醅樣本用無水乙醇浸泡離心，并經適當稀釋后采用氣相色譜分析糟醅中有機酸含量[16]。氣相進樣口溫度為230 ℃，檢測器溫度為230 ℃，載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min，進樣量為1 μL，分流比為30∶1。采用以下梯度條件：初始溫度35 ℃，保持0 min，以4 ℃/min升至60 ℃，保持4 min，以6 ℃/min的速度升溫至195 ℃，保持20 min[16]。

1.3.3 白酒釀造相關微生物的分離篩選與鑒定

取10 g糟醅于含90 mL無菌水的三角瓶中，150 r/min搖床培養30 min，取上清液100 μL稀釋10-3、10-4、10-53個梯度涂布于EG固體培養基(厭氧工作站，37 ℃)，LB固體培養基(恒溫恒濕培養箱，37 ℃)和PDA固體培養基(恒溫恒濕培養箱，28 ℃)，培養2 d后挑取不同形態的單菌落于相應固體培養基上進行純化，純化2～3次后挑取單菌落進行甘油保藏。

取甘油保藏的菌株進行液體培養，培養2 d后吸取1 mL菌液，離心收集菌體沉淀，采用SDS-CTAB法提取菌體DNA，擴增后送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序分析。菌株信息如表1所示。

表1 分離微生物種屬信息

1.3.4 兩種關鍵因子氧氣和黃水對分離微生物的影響

氧氣含量對分離微生物的影響：在裝有150 mL培養基的250 mL錐形瓶中接種5%菌液，分別在厭氧條件和50、150 r/min轉速下振蕩培養，每種梯度設置3個重復，培養24 h后測定OD600值[17]。

黃水濃度對分離微生物的影響：添加25%的高粱培養液為基礎培養基，設置黃水體積分數0%、25%、50%、75%共4個梯度，剩余部分用去離子水補全，每個梯度設置3個重復處理，121 ℃滅菌20 min。以5%的接種量將微生物接種至培養基，置于厭氧條件下培養，24 h后測定OD600值[18]。

2 結果與分析

2.1 上下層原酒風味成分分析

利用HS-SPME-GC/MS測定上下層原酒風味，并對白酒中常見的50種風味物質(圖1)進行分析。基于風味物質含量對原酒進行層次聚類分析，結果顯示上下層原酒各自聚成1簇，說明上下層原酒風味物質含量存在差異。對風味物質含量進行分析可以看出，上層原酒風味物質總量為(2 110.82±348.48)mg/L，下層原酒為(3 757.98±594.87)mg/L(P<0.05)。2種原酒中酯類、酸類、醇類三類化合物的含量之和均占風味物質總量的95%以上，但酯類物質在上層原酒中占比89.58%，在下層中占比94.74%(P<0.05)，酸類和醇類在上層原酒中分別占比3.79%和2.27%，在下層中占比1.69%、1.11%(P<0.05)，上層原酒的風味更為復雜，與沈才萍等[4]的報道一致。在酯類中，上層原酒的酯類含量顯著低于下層原酒(P<0.05)，且決定濃香酒特征風味的4大酯(己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯)在上層原酒中含量顯著低于下層(P<0.05)，可能是由于下層糟醅與窖泥接觸面積更大且厭氧程度更高，有利于己酸菌、梭菌等細菌代謝產生有機酸及進一步合成對應酯類物質。上層原酒的酸類和醛類含量顯著低于下層原酒(P<0.05)，醇類、酚類含量均顯著高于下層原酒(P<0.05)。

圖1 上下層原酒風味成分分析

為了明確上下層原酒風味物質的差異，進行OPLS-DA模型分析，提取2個主成分，PC 1貢獻率36.8%，PC 2貢獻率18.4%，總貢獻率55.2%，基本可以代表樣品的整體信息。結果表明，上層原酒和下層原酒在PC 1上差異較大，在PC 2上差異不明顯。通過化合物的變量投影重要性(variable importance in the projection, VIP)分析，選取VIP>1.2的15個化合物(圖2-b)。由圖2-a可知，己酸丙酯、己酸己酯、乳酸乙酯等10種酯和壬醛、癸醛聚集在下層原酒周圍，表明這些風味物質含量與下層原酒正相關，說明下層原酒酯類物質含量高于上層原酒，濃香型白酒的特征風味物質己酸乙酯也高于上層原酒；1-丁醇、醋酸辛酯和庚酸聚集在下層原酒周圍，與上層原酒正相關，具體原因有待研究。

a-上下層原酒風味OPLS-DA；b-主要差異風味物質

2.2 上下層糟醅相關指標分析

濃香白酒的窖內發酵是復雜的微生物體系與糟醅相互作用的過程，發酵結束后糟醅的各項指標是發酵過程的綜合體現[19]。本研究對比了發酵7 d時上下層糟醅的氧氣含量和發酵結束后上下層糟醅的理化指標及有機酸含量(表2)。

表2 上下層糟醅相關指標

結果表明，發酵7 d時，上層糟醅的氧氣含量顯著高于下層(P<0.05)，可能是由于重力作用，下層糟醅孔隙度較小，也可能是由于糟醅發酵過程中產生的黃水富集于窖池底部。上層糟醅的淀粉含量和pH與下層糟醅無明顯差異，但水分含量、還原糖含量和酸度顯著低于下層(P<0.05)，這可能是由于發酵后期下層糟醅浸泡在黃水中，濕度和酸度較高，抑制了某些微生物的代謝活動，降低了還原糖的利用率。

酸類物質是白酒發酵過程中微生物共同作用的結果，是白酒中重要的呈香呈味物質，也是生成對應酯類物質的前體。上層糟醅中的己酸、丁酸、乙酸含量均顯著低于下層(P<0.05)，這是由于下層糟醅直接接觸窖泥且溶氧系數低，有利于窖泥中的己酸菌、梭菌等厭氧菌代謝產生己酸、丁酸等有機酸，加上黃水受重力作用自然下滲等各種因素，導致下層糟醅中有機酸含量顯著高于上層，最終會使下層原酒中對應酯類物質含量升高，與上文中下層原酒酯類和酸類物質含量明顯高于上層的結論相一致。

2.3 糟醅相關指標與原酒風味相關性分析

從以上結果看，上下層糟醅的相關指標和原酒風味物質含量存在差異，但糟醅指標與原酒中風味物質含量的關系規律不明確，因此通過Spearman相關性分析進一步闡述了糟醅相關指標與原酒風味物質之間的關系，結果見圖3。

圖3 糟醅相關指標與原酒主要風味物質的相關性分析

糟醅的水分含量與醋酸辛酯、正丁醇和正己醇呈顯著負相關，與丁酸乙酯、乳酸乙酯和庚酸乙酯等7種酯以及異丁醇、壬醛等呈顯著正相關；pH與異戊酸異戊酯呈顯著負相關，與丁酸苯乙酯、己酸和2,4-二叔丁基苯酚呈顯著正相關；酸度與正丁醇和正己醇呈顯著負相關，與己酸乙酯和丁酸乙酯等5種酯以及癸醛、壬醛等呈顯著正相關；還原糖含量與醋酸辛酯和2,4-二叔丁基苯酚呈顯著負相關，與乳酸乙酯、乙酸乙酯等5種酯類物質呈顯著正相關；氧氣含量與己酸乙酯、乙酸乙酯和庚酸乙酯等9種酯以及癸醛、(2,2-二乙氧基乙基)-苯呈顯著負相關，與2,4-二叔丁基苯酚呈顯著正相關，其中與氧氣含量呈負相關的4種己酸酯和庚酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、異戊酸異戊酯、癸醛5種物質為上層原酒和下層原酒的主要差異風味物質。綜上可知，糟醅的水分含量和氧氣含量與原酒風味最為相關。主要是由于黃水從上層向下層滲透，有機酸和還原糖等物質向下層遷移，使下層糟醅中香味成分進一步增加，同時由于發酵前期上下層糟醅中氧氣含量不同，使得微生物的生長狀況、代謝強度存在差異[4]，最終導致原酒風味的差異。

2.4 氧氣對分離微生物的影響

由上文可知發酵前期氧氣含量的差異最終會導致原酒風味的差異，而釀造過程的實質是微生物利用原料中的淀粉、還原糖和蛋白質等營養成分產生有機酸和醇類等物質的過程[3]，因此，為探究氧氣影響原酒風味的機理，分析了氧氣對常見白酒釀造微生物的影響。

由表3可以看出當厭氧培養和振蕩培養時，菌株生長量不同，且不同菌株生長量變化趨勢不一致。CT、CS、CA、RU等嚴格厭氧菌，在厭氧條件下生長量較高，而在振蕩培養時生長被抑制。LA、SX、BL、BA、PS等兼性厭氧菌在振蕩培養時隨搖床轉速增大生長量增加，但在厭氧培養時顯示出不同的生長量變化趨勢，其中LA、BL和BA在厭氧培養時生長量顯著高于振蕩培養(P<0.05)，而SX和PS在厭氧培養時生長量顯著低于振蕩培養(P<0.05)。結果表明，不同微生物對氧氣的敏感性有差異，因此發酵前期上下層糟醅氧氣含量的差異會導致微生物群落結構的差異，進而造成發酵前期糟醅中代謝產物的差異[4, 20]，最終造成原酒風味差異。

表3 氧氣含量對分離微生物生長的影響

2.5 黃水對分離微生物的影響

隨發酵的進行窖內氧氣含量逐漸降低(一般在發酵14 d后完全耗盡)[11]，黃水慢慢在窖池底部沉積，酯類物質開始產生并顯著增長[21]，為研究發酵后期黃水是否影響了風味物質的產生，探究了黃水對分離微生物的影響。

如表4所示，隨培養液中黃水濃度升高菌株生長量下降。當黃水體積分數為0%時，菌株生長量較高；黃水體積分數升至20%時，所有菌株的生長量均顯著下降(P<0.05)，且除LA生長量降低17.07%外，其余菌株生長量均減少65%以上；當培養液中黃水體積分數升至50%或75%時，LA仍能生長，但生長量顯著降低(P<0.05)，其余菌株生長均被抑制。徐亞超等[22]研究了黃水的抑菌特性，表明黃水呈酸性時抑菌活性增強，呈堿性時抑菌活性稍有下降，但活性仍較高；盛杰[23]的研究表明黃水在外界條件下抑菌性能幾乎沒有改變，且隨糖添加量和酸度的提升黃水抑菌性能明顯提高；郭輝祥等[24]研究了發酵期間黃水成分變化趨勢，黃水酸度隨發酵時間延長先升高后趨于平緩，發酵35～45 d時，酸度最高。由此可見，黃水具有抑菌性能，且酸度越高抑菌活性越強，與本研究所得結論一致。

表4 黃水對分離微生物生長的影響

綜上，發酵后期黃水會對微生物的生長代謝產生影響。發酵20 d左右時，黃水酸度達到最高值的一半[24]，下層糟醅中大部分微生物的生長代謝被黃水抑制，風味物質的生成主要與發酵前期微生物產生的酶、酸類、醇類等物質有關，同時黃水中含有大量的酸類和醇類等物質，也有利于下層糟醅中酯類物質的生成；另外，上層糟醅中微生物代謝產生的酸類、醇類和酯類等物質也會滲入到下層糟醅，進一步促進下層糟醅中風味物質的積累，增大了上下層糟醅風味物質含量的差異。

3 結論

本研究分析了濃香白酒生產中上下層原酒風味的特點，并探究了造成上下層原酒差異的主要因素。結果表明，上下層原酒風味存在一定差異，主要表現在上層原酒的酯類、酸類和醛類含量低于下層原酒，醇類和酚類含量高于下層原酒，己酸乙酯、乳酸乙酯和正丁醇等15種物質為引起上層和下層原酒差異的主要風味物質。通過相關性分析確定氧氣為引起上下層原酒風味差異的關鍵因素，發酵前期由于不同微生物對氧氣的敏感性不同，上下層氧氣含量的差異會造成微生物代謝物差異，氧氣含量與引起原酒差異的4種己酸酯和其他5種主要風味物質呈顯著負相關。發酵后期，黃水在窖池底部沉積，當黃水濃度達到50%時會抑制大部分微生物的生長，風味物質的生成主要受發酵前期微生物產生的代謝物和黃水的影響。研究結果表明，上下層原酒風味的差異主要受發酵前期的氧氣和發酵后期黃水的影響，因此可以通過對發酵前期窖內氧氣含量和后期黃水的控制提升上層酒的品質，進而提高優質濃香型原酒的產量。