七氟醚對腦缺血再灌注損傷大鼠海馬神經元ATP酶活性的影響及其機制分析

缺血性腦卒中是導致全球人類死亡和殘疾的主要原因之一。除可導致各種嚴重的身體缺陷(包括認知功能障礙)外，還可能具有導致學習障礙和運動障礙的風險，從而影響患者的生活質量

。缺血再灌注損傷(IRI)常發生于當一段時間血液供應不足后，隨后的血液進行再灌注，引起的一種缺血器官和組織的結構和功能無法恢復的神經損傷

。腦缺血后的再灌注可導致腦損傷，如神經元死亡、神經血管損傷、腦水腫以及出血性轉化。腦IRI細胞損傷的機制包括炎癥、細胞凋亡、活性氧和氮物質(ROS/RNS)的過量產生和興奮性毒性

。盡管以前的研究表明，某些藥物具有潛在的神經保護作用，如Pim-1激酶、肉桂蛋白和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，但另有研究表明這些藥物的保護作用是間接的及有限的

。因此腦IRI仍然是心血管疾病研究的主要問題，需要進一步研究。七氟醚是一種揮發性的靜脈內藥物，常用于麻醉領域

。據報道，七氟醚預處理可通過促進小膠質細胞活化來誘導腦缺血損傷的內源性神經發生

。七氟醚麻醉與術后認知功能障礙有關，但可通過抑制核因子κB(NF-κB)/P6信號通路來緩解認知障礙

。先前的報道表明七氟醚可以增加腦IRI中的三磷酸腺苷ATP酶活性

，但具體的機制還尚未徹底闡明。本研究旨在探討七氟醚對IRI大鼠海馬神經元ATP酶活性的影響并分析其機制，為七氟醚的神經保護作用提供實驗依據，同時為IRI的治療提供新思路及新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 30只雄性SD大鼠購自沈陽藥科大學實驗動物中心，8～12周齡，180～250 g。所有大鼠飼養在室溫(22±1)℃的動物房中，光/暗(12/12)循環，自由飲食。將所有大鼠隨機分為3組：正常組，模型組和七氟醚組，每組各10只。

1.2 局灶性腦IRI大鼠模型構建 采用Longa提出的大腦中動脈閉塞(MCAO)對模型組和七氟醚組建立局灶性IRI大鼠模型。首先，大鼠給予腹膜內注射10%水合氯醛進行麻醉后，通過中線頸部切口暴露出翼腭動脈(PPA)、頸總動脈(CCA)和頸外動脈(ECA)。將0.23 mm的尼龍單絲引入右頸總動脈(RCCA)，結扎ECA和CCA的近端部分。用鉗子夾住頸內動脈，用5-0針在CCA結扎區域切開一個切口，將腔內縫合線引入切口，并松開鉗子。將腔內縫合線從CCA分叉處(約20 mm)插入，插入時感覺很順暢，沒有阻力，調整方向和角度，前進至頸小動脈前部的起始部位，有阻力阻礙。右腦中動脈栓塞，并用絲線縫合皮膚切口。缺血2 h后，小心取出腔內縫合線，然后進行再灌注。正常組除插入尼龍單絲外，其余方法與模型組相同。

1.3 七氟醚治療 七氟醚組大鼠在建模過程中采用七氟醚治療。大鼠麻醉后，采用呼吸機對大鼠進行插管和通氣，潮氣量為5 mL/100 g，呼吸頻率為60～70次/min，呼吸商為1/2。呼吸機末端連接七氟醚麻醉，麻醉氣體監測儀連接到動物呼吸機的進氣口。然后解除麻醉機的自發呼吸模式，給大鼠補充氧氣2 L/min，在建模手術過程中用麻醉氣體監測儀吸入1.5%的七氟醚。正常和模型組大鼠給予100%新鮮空氣，30 min/次，1次/d。監測生理指標并使大鼠直腸溫度維持在(37±0.5)℃。實驗后，將大鼠斷頭處死，在冰上分離雙側海馬，一部分置于液氮中速凍，并儲存于－80 ℃以備Western Blot和RT-PCR檢測。一部分放入2.5%的戊二醛中，于4 ℃固定2 h，用于電鏡觀察。其余部分置于4%的中性甲醛固定，用于免疫組化和免疫熒光檢測。

1.4 電鏡觀察 將2.5%戊二醛固定后的海馬組織用二甲砷酸鹽緩沖液清洗，3次2 min。用1%四氧化鋨進行后固定2 h，經各級乙醇脫水后用Epon618樹脂包埋，將包埋后的組織用切片機切為500 nm厚的超薄切片。之后采用1%乙酸雙氧鈾初染，再用檸檬酸鉛復染。用日本電子光學實驗室提供的JEM-3200FS場發射透射電子顯微鏡觀察組織切片，并進行拍照，放大倍數為60 000×。

1.5 免疫熒光 將各組大鼠海馬組織用4%的中性甲醛固定12 h，經各級酒精脫水，二甲苯透明，將腎組織包埋于石蠟中，用切片機將含有組織的石蠟塊切成5 mm厚的切片，用載玻片展片、撈片，備用。將上述組織切片在500 μL預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中漂洗3 次，在室溫下用0.5% Triton X-100 X透化20 min，PBS洗3次。在37 ℃培養箱中用10%胎牛血清(BSA)封閉30 min，滴加一抗(兔抗小鼠MAP-2抗體，1∶500，上海碧云天公司)，4 ℃盒中培養過夜。PBS洗3次，滴加熒光標記的二抗(兔抗小鼠MAP-2抗體，1∶200，上海碧云天公司)，37 ℃濕盒中避光孵育1 h，PBS洗3次。細胞核用二亞氨基-2- 苯基吲哚(DAPI)避光染色5 min，PBS洗4次，用熒光淬滅劑密封。在熒光顯微鏡下(日本Olympus公司) 觀察并記錄MAP-2陽性細胞在細胞總數中的百分比。

隨著高職教育發展，辦學規模擴大，各高職院校在辦學經驗、教學設施、師資力量、教育經費等軟硬件條件上都存在一定不足。尤其是發展資金投入相對不足、職業教育發展相對落后的西部地區，各高職院校如何共享、利用校際資源、社會資源、企業資源、網絡資源等，提升資源利用效率，就成了各高職院校解決辦學條件不足問題、提升人才培養質量和辦學水平的主要途徑。

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2.5 各 組 大 鼠 海 馬 組 織cAMP、PKA、CREB 和BDNF mRNA表達比較 與對照組相比，模型組大鼠海馬組織cAMP、PKA、CREB和BDNF mRNA表達顯著降低(

＜0.05)。與模型組相比，七氟醚組大鼠海馬組織cAMP、PKA、CREB和BDNF mRNA表達顯著增加(

＜0.05)。這些結果表明七氟醚可增加腦IRI大鼠海馬組織cAMP、PKA、CREB和BDNF mRNA表達，見圖5。

1.6 免疫組化 上述切片經常規脫蠟脫水后，3%過氧化氫(H

O

)室溫孵育10 min，洗3次，置于PBS溶液中，微波加熱至95 ℃保持10 min，冷卻。5%胎牛血清封閉45 min，加入cAMP一抗(1∶50)或PKA一抗(1∶100)，4 ℃孵育過夜，洗3次，滴加二抗，室溫孵育1 h，洗3次，加入SABC復合物，室溫孵育1 h，洗3次，滴加二氨基聯苯胺(DAB)顯色液，10 min后洗去，蘇木精淡染細胞核，0.5%鹽酸乙醇分化7 s，洗3次，經各級酒精脫水后透明，中性樹膠封片。一抗、二抗、SABC復合物及DAB顯色液均購自上海碧云天公司。奧林巴斯Olympus光學顯微鏡下觀察目的蛋白的表達，并采用Image Pro Plus軟件統計目的蛋白的陽性表達率。

2.1 各組大鼠海馬組織電鏡觀察結果比較 正常組海馬神經元細胞膜結構完整，細胞器豐富和染色體分布均勻。模型組海馬神經元胞體萎縮，細胞膜呈現不完整跡象和染色質濃縮，聚集在細胞核邊緣。七氟醚組海馬神經元收縮明顯減少，細胞形態明顯改善。這些結果表明七氟醚可以減輕腦IRI大鼠的神經元損傷，改善細胞形態，見圖1。

2.6 各 組 大 鼠 海 馬 組 織cAMP、PKA、CREB 和BDNF蛋白表達比較 與對照組相比，模型組大鼠海馬組織cAMP、PKA、CREB和BDNF蛋白表達顯著降低(

＜0.05)。與模型組相比，七氟醚組大鼠海馬組織cAMP、PKA、CREB和BDNF蛋白表達顯著增加(

＜0.05)。這些結果表明七氟醚可增加腦IRI大鼠海 馬 組 織cAMP、PKA、CREB 和BDNF 蛋 白 表 達，見圖6。

1.9 Western Blot 采用RIPA蛋白裂解液提取各組大鼠海馬組織中的總蛋白，BCA試劑盒進行總蛋白的定量分析。將20 g總蛋白加入上樣緩沖液中，用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白，然后將總蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5% BSA封閉45 min，孵育一抗，4 ℃過夜，洗膜緩沖液(TBST)洗3次。加入二抗，室溫搖床孵育1 h，TBST洗3次，采用電化學發光試劑(ECL)于暗室發光。采用美國Bio-Rad公司的凝膠成像系統及Quantity One 4.6.2軟件對目的條帶進行分析。GAPDH為內參。兔多克 隆 抗 體cAMP、PKA、CREB、BDNF 和GAPDH 抗體，山羊抗兔二抗均購自上海碧云天公司。

2.2 各組大鼠海馬神經元損傷情況比較 正常組大鼠海馬組織中MAP-2陽性神經元最多，胞體最大，突觸最多。模型組MAP-2陽性神經元最少，胞體較小和突觸最少。七氟醚組大鼠MAP-2陽性神經元和突觸增加，并展現出增大的胞體。對MAP-2陽性細胞占細胞總數百分比的統計結果顯示，正常組MAP-2陽性細胞占比(41.5±5.61)%，模型組占比(18.6±3.49)%，七氟醚組占比(32.8±4.57)%。與對照組相比，模型組大鼠海馬組織MAP-2陽性細胞占比顯著降低(

＜0.05)。與模型組相比，七氟醚組大鼠海馬組織MAP-2陽性細胞占比顯著增加(

＜0.05)。這些結果進一步證實七氟醚可修復腦IRI大鼠海馬神經元損傷，見圖2。

2 結果

1.7 ATP酶活性檢測 采用上?？∪鹕锛夹g有限公司提供的超納米Na

-K

-ATP酶試劑盒和超納米Ca

ATP酶試劑盒檢測ATP酶活性，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.3 各組大鼠海馬組織cAMP和PKA蛋白表達比較 對各組大鼠海馬cAMP和PKA蛋白陽性表達統計結果顯示，正常組cAMP陽性表達為(2.4±0.46)，模型組為(0.8±0.29)，七氟醚組為(1.9±0.31)。與對照組相比，模型組大鼠海馬組織cAMP陽性表達顯著降低(

＜0.05)。與模型組相比，七氟醚組大鼠海馬組織cAMP陽性表達顯著增加(

＜0.05)。正常組PKA 陽 性 表 達 為(3.2 ±0.43)，模 型 組 為(1.1±0.28)，七氟醚組為(2.8±0.36)。與對照組相比，模型組大鼠海馬組織PKA陽性表達顯著降低(

＜0.05)。與模型組相比，七氟醚組大鼠海馬組織PKA陽性表達顯著增加(

＜0.05)。這些結果表明七氟醚可增加腦IRI大鼠海馬組織cAMP和PKA蛋白表達，見圖3。

2.4 各組大鼠海馬組織ATP酶活性比較 與對照組相比，模型組大鼠海馬組織Na

-K

-ATP酶和Ca

-ATP酶活性顯著降低(

＜0.05)。與模型組相比，七氟醚組大鼠海馬組織Na

-K

-ATP 酶和Ca

-ATP酶活性顯著增加(

＜0.05)。這些結果表明七氟醚可增加腦IRI大鼠海馬組織ATP酶活性，見圖4。

牛津閱讀樹，作為牛津出版社的經典暢銷產品，也不是隨隨便便獲得市場成功的。它的背后是英國教育工作者、兒童心理學家、出版工作者多年科研成果的支撐，目前一共大約800本書，也是近二十年來邊摸索邊充實而成的一個巨大的資源庫，內容有故事、科普、詩歌，作者隊伍超級強大，幾乎個個是名家。這套原本是針對英美等英語國家初等教育而設計的課外閱讀讀物，不經意趕上了全球學英語的潮流，火遍全世界；又趕上中國大陸的繪本熱，也影響到了中國的許多家庭。

腦IRI是全球醫務工作者和科研人員的研究重點和難點。本研究探討七氟醚對腦IRI大鼠海馬神經元ATPase活性的影響，結果提示七氟醚可以通過激活cAMP-PKA信號通路來促進腦IRI大鼠海馬神經元ATPase的活性。

1.8 RT-PCR檢測 采用TriZol裂解液各組大鼠海馬組織中的總RNA，分別檢測總RNA 260 nm和280 nm處的吸光值A，根據A260/A280的比值對總RNA定量。之后取上述總RNA模板1 g，用反轉錄試劑盒(M-MLV)合成第一鏈cDNA。以此cDNA為模板，加入SYBR mix、特異性引物和水，采用Bio-Rad熒光定量PCR儀進行擴增。同時用磷酸甘油醛脫氫(GAPDH)作為內參。采用2

計算目的基因的相對表達量。所有引物均由Primer designing tool軟件(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設計并由上海生工公司合成。

3 討論

Levels of LD in proximal subtotal gastrectomy: (1)D0: LD in a volume less than D1; (2) D1: №1, 2, 3a,4sa, 4sb, 7; and (3) D1 +: D1 plus №8a, 9, 11p (Figure 4).

本研究電鏡結果以及免疫熒光結果均顯示七氟醚可改善大腦IRI大鼠海馬神經元的形態，并增加海馬神經元的含量。這與先前的報道一致，七氟醚后處理可通過恢復線粒體形態來減弱心肌細胞的缺氧/復氧損傷

。另一項研究也表明，七氟醚可抑制心肌缺血/再灌注損傷(MIRI)后的心肌組織凋亡

，具有心臟保護作用。這些研究及結果顯示，七氟醚可修復腦IRI后海馬神經元的結構，在神經元保護中起重要作用。

在社會主義市場經濟條件下，涉及到礦產資源資產的資源交易、礦業市場融資、股東權益分配、監管、國際礦產資源資產交流等方面內容日趨增多，為適應市場發展的需求，促使礦產資源資產評估更好地融入現代資本市場，我們更應該加快我國礦產資源資產標準規范的制定工作，增強礦產資源資產評估過程中的資產認定、屬性、資產邊界、產權標準、關鍵術語定義、評估原則等方面的規范和研究，建立一套適應于我國國情的礦產資源資產評估標準體系，對于協助礦業企業管理決策、協助礦產資源資產行政管理和監督管理、完善礦業企業的公司管制、促進礦業企業融資和相關交易等具有重要意義。

研究報道七氟醚可增強ATPase的活性

。這與我們的研究一致，七氟醚可以增加IRI大鼠海馬組織Na

-K

-ATP酶和Ca

-ATP酶活性。先前的體外研究表明，七氟醚對干擾素調節因子6(LPS)損傷的Ⅱ型人肺泡上皮細胞(AEC Ⅱ)中的Na

-K

-ATP酶具有刺激作用

。研究報道，當用缺乏細胞外鈣的培養基灌注膽堿能細胞時，七氟醚誘導的Ca

-ATP酶活性仍保持上調

。已發現七氟醚可通過改善心內膜下心肌線粒體形態和血流動力學，阻斷mPTP的開放和激活線粒體KATP通道來減少心肌梗死面積

。也有報道顯示，一些揮發性麻醉劑(如地氟醚、氟烷、異氟烷或七氟醚)對腎臟IRI具有深遠的保護作用

。其他研究還表明，七氟醚可通過轉化生長因子β

途徑來預防腎臟IRI

。這些研究均顯示，七氟醚可增強ATPase的活性。

4）獲得多項國家及行業榮譽稱號。中海建滔、中?；瘜W、惠州煉化、湖北大峪口分別榮獲了國家發改委、工信部、中國石油和化學工業聯合會頒發的甲醇、合成氨、原油加工和磷酸二銨“能效領跑者標桿企業”稱號；有限公司湛江分公司等三家企業因節能工作突出分別獲得全國總工會“全國五一勞動獎章”、“工人先鋒號”等榮譽稱號。

Na

-K

-ATP酶是位于腎臟近端小管的整合性膜蛋白，其作用是為某些溶質的重吸收和分泌提供能量。Na

-K

-ATP酶活性紊亂與腦IRI的病理生理有關。IRI可導致三磷酸腺苷(ATP)合成降低，并進一步導致ATPase活性下降

。已證明腎臟Na

-K

-ATP酶參與腦IRI的腦水腫和神經元損傷的調控過程，這是腦IRI的中樞發病機制

。據報道Na

-K

-ATP酶在七氟醚對IRI的保護中具有重要作用

。此外，ATPase活性受cAMP-PKA信號通路的調控

。我們的研究進一步證明七氟醚可通過上調大鼠海馬神經元中cAMP、PKA、CREB和BDNF的表達來改善海馬神經元。研究表明，cAMP/CREB信號的下調參與七氟醚-一氧化二氮全身麻醉引起的神經毒性和認知功能障礙過程

。另有研究證明cAMP/CREB級聯對新生海馬神經元的成熟和分化有很大影響，而cAMP信號通路的激活可以促進海馬神經元的形態成熟

。吸入性七氟醚已被證明可促進離體血小板中α

-腎上腺素信號傳導中PKA活性的顯著增加

。BDNF是cAMP-PKA-CREB-BDNF信號通路的下游元素

。七氟醚可能通過調節海馬BDNF表達來抑制應激增強的恐懼學習

。

綜上所述，本研究表明七氟醚可以通過激活cAMP-PKA-CREB-BDNF信號通路來促進腦IRI大鼠海馬神經元的ATPase活性，進一步改善腦IRI，這可能為腦IRI的治療提供新思路。

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