通腑茯苓飲聯合電針治療大鼠骶上脊髓損傷后神經源性膀胱的作用機制研究*

張昱，孔繁林，吳磊

[1.山西白求恩醫院（山西醫學科學院），山西太原 030032；2.山西農業大學生命科學學院，山西晉中 030801]

神經源性膀胱（neurogenic bladder, NB）是由于中樞神經系統損傷導致的膀胱尿道功能障礙，主要表現為尿不暢或潴留，嚴重時引發尿路感染或腎衰竭，造成死亡[1]。脊柱損傷是造成NB 的主要原因，其中以骶上脊髓損傷（suprasacral spinal cord injury,SSCI）最常見[2]。中醫將其歸為“癃閉”“遺溺”等范疇[3]。目前NB 主要采用手術和保守治療，但手術效果有限且創傷較大，中醫以湯藥與針灸治療最常見。目前針對SSCI 后NB 采用針刺較多，而湯藥與針灸聯合治療的研究較少，且尚無確切的作用機制[4]。為提高療效，本研究選用中藥與電針聯合治療。湯藥選用通腑茯苓飲進行調理，該藥方是根據《金匱要略》中葵子茯苓散加減而來，具有通調水道、行氣利水的功效[5]。針刺則選用長強穴和維胞穴進行電針治療。長強穴屬督脈，位于脊柱骨的尾端，督陽初始之處，能夠增強督脈陽氣，調暢通淋，治療大小便難解；維胞穴則位于下腹部，主治遺尿，尿潴留等，具有調理沖任，行氣止痛的功效[6]。為探究其聯合治療的效果及作用機制，本研究復制SSCI后NB 大鼠模型，探究通腑茯苓飲聯合電針治療大鼠SSCI 后NB 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

45 只SPF 級、SD 雌性大鼠，體重190～220 g，平均（205±15）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2019-0030。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑通腑茯苓飲所用藥材（山西國藥醫藥集團有限公司），戊巴比妥鈉（CAS 號：57-33-0，上海譜析生物科技有限公司，貨號：XY-TP276000），中性甲醛（CAS 號：50-00-0，上海遠慕生物科技有限公司，貨號：YR0267），TRIzol 試劑盒（武漢純度生物科技有限公司，貨號：CD-13433-ML），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司，貨號：MQPS），神經生長因子（nerve growth factor, NGF）、神經生長因子受體（nerve growth factor receptor, TrkA）單克隆抗體（北京安諾倫生物科技有限公司，NGF 抗體貨號：LM12882；TrkA 抗體貨號：LM21146）。

1.2.2 主要儀器咬骨鉗（蘇州威邦醫療器械有限公司），一次性針灸針（型號：25mm，北京漢醫醫療器械中心），SDZ-Ⅱ型華佗牌電針治療儀（蘇州醫療用品廠有限公司），基礎電泳儀（型號：Mini-protean tetra mini，美國Bio-Rad 公司），真空干燥箱（型號：FD8-3T，美國GOLD-SIM 公司），紫外分光光度計（型號：BioSpectrometerD30，德國Eppendorf 公司）。

1.3 方法

1.3.1 SSCI 模型的復制及分組所有大鼠飼養于SPF 區域，溫度保持在20℃左右，濕度為55%～60%，大鼠食量一般為100 g/（kg·d），每日給予充足的飼料和水。根據Hassan Shakerl 脊髓橫斷法[7]，復制大鼠SSCI 模型。采用隨機數字表法將45 只雌性大鼠分為對照組（8 只）和實驗組（37 只）。實驗組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后復制SSCI 模型。將大鼠俯臥固定，脊柱胸椎下段消毒、備皮，找到T10椎體，從此處切開皮膚，分離皮下組織，暴露T10、T11棘突及椎板，用咬骨鉗咬除T10椎板及兩側關節突，暴露出脊髓并將其切斷（可反復切割，確保脊髓完全切斷，無神經纖維殘留），觀察大鼠生命體征后縫合。大鼠清醒后，采用病理評分評估大鼠脊髓橫斷情況[7]：0 分（后肢癱瘓，無任何運動）表明脊髓橫斷成功。術后抗感染治療7 d，每日手法排尿，并記錄尿量。2 周后膀胱出現尿潴留，表明大鼠SSCI 后NB 模型復制成功。實驗組5 只大鼠模型復制失敗（3 只死亡，2 只未出現尿潴留），其余大鼠隨機分為模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯合組，每組8 只。

1.3.2 藥物處理通腑茯苓飲組方：茯苓10 g、車前子15 g、烏藥6 g、琥珀3 g、黃芪30 g、白術20 g、澤瀉10 g、冬葵子10 g、通草6 g、滑石10 g、牛膝15 g，制成生藥含量為1 g/mL 的通腑茯苓飲，備用。模型復制成功后，根據人與大鼠的體重及給藥劑量換算公式[9]，通腑茯苓飲組給予通腑茯苓飲6.25 g/（kg·d），連續服用14 d；電針組采用0.3 mm×25.0 mm 的電針，對長強穴和維胞穴進行針刺，電針儀參數設定為10/50 Hz（疏波10 Hz/5 s，密波50 Hz/9 s），留針20 min，1 次/d，連續14 d。

1.3.3 標本采集及處理最后一次治療后對大鼠進行尿流動力學檢測。檢測后所有大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，采用手法輔助大鼠排尿，記錄其殘余尿量。在麻醉狀態下剝離大鼠背部皮膚、肌肉及組織，分離暴露胸椎段T8～T12脊髓，切除T9～T10脊髓后用生理鹽水沖洗，每組4 只大鼠的脊髓于4%中性甲醛中固定，用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色；另4 只大鼠的脊髓置于-80℃冷凍保存，用于檢測mRNA 和蛋白的表達。

1.3.4 大鼠尿流動力學檢測排空膀胱后，大鼠仰臥位固定，將三通導管中的空氣排空，一端由尿道插入膀胱并固定，一端連接測壓通道，另一側連接微量灌注泵，記錄膀胱基礎壓力后，向膀胱中勻速注入溫生理鹽水（0.2 mL/min），密切觀察膀胱壓力變化，當尿道口有液體流出時，記錄此時壓力值，為膀胱漏尿點壓力，此時注入的生理鹽水容量為膀胱最大容量。液體流出后繼續注入溫生理鹽水，至逼尿肌壓力穩定，根據公式計算得出膀胱順應性。膀胱順應性=膀胱容量的變化/壓力變化。

1.3.5 大鼠脊髓組織HE 染色及病理學評分取固定好的脊髓組織標本，70%乙醇脫水，透明，石蠟包埋，切片厚約4 μm，HE 染色，封片后置于光鏡下觀察脊髓組織病理變化，并進行病理學評分。0 分：無炎癥細胞浸潤，1 分：炎癥細胞僅出現在血管周圍；2～4 分：脊髓周圍出現輕、中、重度炎癥細胞浸潤[10]。

1.3.6 qRT-PCR 檢測大鼠脊髓組織NGF、TrkA mRNA 的表達取部分冷凍保存的脊髓組織，根據TRIzol 試劑盒說明書提取脊髓組織總RNA，采用紫外吸收法檢測純度及濃度，以總RNA 為模板，逆轉錄為cDNA，qPCR 反應體系：SYBR 4 μL，正反向引物各1 μL，cDNA 模板4 μL，H2O 加至20 μL；擴增條件：95℃預變性2 min；95℃變性10 s，58℃退火15 s，72℃延伸10 s，共40 個循環。β-actin 為內參基因，采用2-ΔΔCT法計算脊髓組織NGF、TrkA mRNA 相對表達量，NGF、TrkA 及內參引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.7 Western blotting 檢測大鼠脊髓組織NGF、TrkA 蛋白的表達取冷凍保存的脊髓組織研磨勻漿，加入裂解液對組織進行裂解，測定蛋白濃度，電泳分離目的蛋白，采用PVDF 膜進行轉膜，用Western洗滌液洗去轉膜液，封閉1 h，按一抗說明書進行稀釋，加入一抗NGF、TrkA 及內參后在4℃條件下，搖床孵育過夜，再加入山羊抗兔二抗，孵育2 h，最后顯影得到結果[11]。蛋白相對表達量=目的蛋白積分光密度值（IOD）/β-Actin IOD。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠膀胱重量、殘余尿量比較

對照組、模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯合組大鼠膀胱重量、殘余尿量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=90.861 和27.951，均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯合組的膀胱重量、殘余尿量增加（P＜0.05）；與模型組比較，通腑茯苓飲組、電針組及聯合組的膀胱重量、殘余尿量減少（P＜0.05）；與通腑茯苓飲組比較，電針組及聯合組的膀胱重量、殘余尿量減少（P＜0.05），與電針組比較，聯合組的膀胱重量、殘余尿量減少（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠膀胱重量、殘余尿量比較 （n=8，±s）

表2 各組大鼠膀胱重量、殘余尿量比較 （n=8，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與通腑茯苓飲組比較，P ＜0.05；④與電針組比較，P ＜0.05。

組別對照組模型組通腑茯苓飲組電針組聯合組F 值P 值膀胱重量/g 0.18±0.04 0.86±0.08①0.79±0.03①②0.68±0.07①②③0.56±0.13①②③④90.861 0.000殘余尿量/mL 0.16±0.04 3.25±1.08①2.26±0.62①②1.65±0.47①②③1.16±0.39①②③④27.951 0.000

2.2 各組大鼠尿流動力學指標比較

對照組、模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯合組大鼠膀胱漏尿點壓力、膀胱順應性及膀胱最大容量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=25.988、23.317 和63.828，均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯合組的膀胱漏尿點壓力升高，膀胱順應性降低、膀胱最大容量減少（P＜0.05）；與模型組比較，通腑茯苓飲組、電針組及聯合組的膀胱漏尿點壓力降低，膀胱順應性升高、膀胱最大容量增加（P＜0.05）；與通腑茯苓飲組比較，電針組及聯合組的膀胱漏尿點壓力降低，膀胱順應性升高、膀胱最大容量增加（P＜0.05），與電針組比較，聯合組的膀胱漏尿點壓力降低，膀胱順應性升高、膀胱最大容量增加（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠尿流動力學指標比較 （n=8，±s）

表3 各組大鼠尿流動力學指標比較 （n=8，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與通腑茯苓飲組比較，P ＜0.05；④與電針組比較，P ＜0.05。

膀胱最大容量/mL 4.58±1.04 0.66±0.15①1.12±0.17①②1.85±0.21①②③2.56±0.55①②③④63.828 0.000組別對照組模型組通腑茯苓飲組電針組聯合組F 值P 值膀胱漏尿點壓力/cmH2O 36.18±2.34 53.46±5.71①46.68±3.63①②42.64±3.56①②③38.97±2.63①②③④25.988 0.000膀胱順應性/（mL/cmH2O）0.31±0.11 0.03±0.01①0.08±0.03①②0.13±0.05①②③0.20±0.07①②③④23.317 0.000

2.3 各組大鼠脊髓組織病理變化及評分比較

HE 染色結果顯示，對照組脊髓結構完整，神經細胞核膜清晰，分布均勻，無明顯炎癥細胞浸潤；模型組可見炎癥細胞浸潤，血管周圍可見“管套狀”結構；與模型組比較，通腑茯苓飲組、電針組及聯合組炎癥細胞浸潤減少，局部可見“管套狀結構”。見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓組織病理切片 （HE染色×200）

對照組、模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯合組大鼠脊髓組織病理評分分別為（0.00+0.00）分、（3.61±0.38）分、（2.68±0.28）分、（1.91±0.20）分和（1.02±0.11）分，經方差分析，差異有統計學意義（F=143.713，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯合組病理評分升高（P＜0.05）；與模型組比較，通腑茯苓飲組、電針組及聯合組病理評分降低（P＜0.05）；與通腑茯苓飲組比較，電針組及聯合組病理評分降低（P＜0.05），與電針組比較，聯合組病理評分降低（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠脊髓組織NGF、TrkA mRNA 相對表達量比較

對照組、模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯合組大鼠脊髓組織NGF、TrkA mRNA 相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=63.286 和141.237 均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯合組NGF、TrkA mRNA 相對表達量降低（P＜0.05）；與模型組比較，通腑茯苓飲組、電針組及聯合組NGF、TrkA mRNA 相對表達量升高（P＜0.05）；與通腑茯苓飲組比較，電針組及聯合組NGF、TrkA mRNA 相對表達量升高（P＜0.05），與電針組比較，聯合組NGF、TrkA mRNA 相對表達量升高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠脊髓組織NGF、TrkA mRNA相對表達量比較 （n=4，±s）

表4 各組大鼠脊髓組織NGF、TrkA mRNA相對表達量比較 （n=4，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與通腑茯苓飲組比較，P ＜0.05；④與電針組比較，P ＜0.05。

TrkA mRNA 1.37±0.06 0.66±0.04①0.83±0.04①②1.10±0.09①②③1.22±0.05①②③④141.237 0.000組別對照組模型組通腑茯苓飲組電針組聯合組F 值P 值NGF mRNA 0.94±0.04 0.56±0.02①0.71±0.03①②0.82±0.05①②③0.87±0.04①②③④63.286 0.000

2.5 各組大鼠脊髓組織NGF、TrkA 蛋白相對表達量比較

對照組、模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯合組大鼠脊髓組織NGF、TrkA 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=239.253 和72.746 均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯合組NGF、TrkA 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與模型組比較，通腑茯苓飲組、電針組及聯合組NGF、TrkA蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與通腑茯苓飲組比較，電針組及聯合組NGF、TrkA 蛋白相對表達量升高（P＜0.05），與電針組比較，聯合組NGF、TrkA 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見表5 和圖2。

表5 各組大鼠脊髓組織NGF、TrkA蛋白相對表達量比較（n=4，±s）

表5 各組大鼠脊髓組織NGF、TrkA蛋白相對表達量比較（n=4，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與通腑茯苓飲組比較，P ＜0.05；④與電針組比較，P ＜0.05。

TrkA蛋白2.04±0.25 0.47±0.05①0.72±0.09①②0.84±0.08①②③1.30±0.16①②③④72.746 0.000組別對照組模型組通腑茯苓飲組電針組聯合組F 值P 值NGF蛋白1.43±0.04 0.71±0.05①0.89±0.04①②0.97±0.03①②③1.31±0.03①②③④239.253 0.000

圖2 各組大鼠脊髓組織NGF、TrkA蛋白的表達

3 討論

SSCI 后NB 是由中樞神經系統受損導致，中醫認為SSCI 后NB 的病機為淤血凝滯、督脈不同。電針能夠促進內源性神經干細胞增殖分化，有利于神經細胞的恢復。中醫常用電針治療NB，其在穴位功效的基礎上，采用電刺激，在穴位之間形成電流，更深度刺激穴位發揮功效。廖福金等[12]研究結果顯示，針刺長強穴能夠改善SSCI 后NB 大鼠的排尿能力，改善膀胱功能。因此，本研究選用長強穴和維胞穴進行電針刺激，2 個穴位能夠在體內形成一條電流，起到通督補腎、恢復膀胱氣化的作用[13]。加之通腑茯苓飲的利水、理氣加速代謝的作用，通過多方面對SSCI 后NB 進行調理，但其作用機制尚不確切。NGF、TrkA 對中樞神經元的發育、再生及功能特性的表達均有一定的調控作用。有研究證實，NGF、TrkA 能夠加速神經元的修復[14]，因此推測NGF-TrkA 信號通路在NB 中發揮一定作用。

本研究通過Hassan Shakerl 脊髓橫斷法復制SSCI 模型，該方法能夠完全橫斷脊髓并準確定位脊髓損傷部位，有利于后續切片觀察，且較為簡便。采用通腑茯苓飲、電針及兩者聯合對SSCI 后NB 的作用進行比較，結果表明通腑茯苓飲、電針治療SSCI 后NB 均有一定療效，其中聯合治療對于膀胱功能及尿流動力學指標的改善效果更明顯。本研究中大鼠脊髓組織病理變化及病理評分結果同樣證實聯合治療對大鼠脊髓組織的修復作用更明顯，能減少炎癥細胞浸潤。分析其原因為通腑茯苓飲由茯苓、車前子、烏藥、琥珀、黃芪、白術、澤瀉、冬葵子、通草、滑石、牛膝組成；其中茯苓健脾利水；車前子利水通淋；烏藥溫腎行氣，腎氣化生，致膀胱氣化，尿液排出；琥珀宣竅；重用黃芪補氣升陽，健脾益肺，利水消腫、活血化瘀，于補益中兼具通瀉之功；白術、澤瀉健脾利水，佐以冬葵子、滑石、通草，增強滑竅利水通淋之功；牛膝通經活血、利水通淋、祛除邪結[15]。通腑茯苓飲聯合電針刺激長強穴及維胞穴，能夠發揮通調水道、行氣利水的功效，同時強督脈陽氣，調暢通淋，多種作用途徑增強膀胱功能，使其效果顯著優于通腑茯苓飲及電針單獨治療。

NGF 是神經營養因子中的一種，對神經的生長、損傷過程均有一定影響。此外，NGF 還可以保護細胞免受氧化應激損傷，TrkA 是NGF 受體，能夠促進神經元出芽，修復受損的神經回路[16]。當脊髓受損時，NGF 能促進神經細胞凋亡。本研究結果表明，SSCI 后NB 大鼠脊髓組織NGF、TrkA mRNA 和蛋白相對表達量降低，可能是檢測時NGF、TrkA 已處于高峰后的下降時期。經電針或通腑茯苓飲治療后，NGF、TrkA mRNA 和蛋白相對表達量升高，而兩者聯合治療后NGF、TrkA mRNA 和蛋白相對表達量接近正常水平。分析期原因為NGF 與受體TrkA 特異性結合后激活NGF，能夠維持神經元活性，加速突觸成熟，使軸突延長，促進中樞神經系統的發育和修復[17]。通腑茯苓飲可能通過激活P13K/Akt 信號通路，抑制脊髓損傷神經細胞的凋亡，促進神經元的出芽及神經回路的重建，加速神經再生，從而減輕脊髓損傷[18]。本研究結果提示通腑茯苓飲聯合電針能夠有效激活NGF-TrkA 信號通路，減輕SSCI 后NB 對大鼠膀胱及脊髓的損傷。

綜上所述，通腑茯苓飲聯合電針能夠改善SSCI后NB 大鼠膀胱功能，其作用機制可能與NGF-TrkA信號通路有關。未來可對NGF、TrkA 上下游蛋白進行深入研究，進一步驗證通腑茯苓飲聯合電針對NGF-TrkA 信號通路的調控作用，為治療SSCI 后NB提供科學依據。