嘌呤能受體X1與肺腺癌預后及免疫細胞浸潤的相關性研究

于運亮，王莉莉，李 婷，封建凱，*

(1．濱州醫學院煙臺附屬醫院檢驗科，山東煙臺 264100；2．煙臺市煙臺山醫院病理科，山東 煙臺264000)

ATP受體在腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)中廣泛表達于免疫細胞表面，細胞外ATP可與受體結合直接影響癌癥進展[1]。嘌呤能受體X1(purinergic receptor，P2RX1)作為ATP門控離子通道受體家族成員，與免疫細胞激活、腫瘤進展及炎癥因子的釋放等有關[2-4]。P2RX1作用于酸性核磷蛋白32A可影響乙?；{控分子H3的富集進而促進白血病的發生[5]。胰腺癌肝轉移TME中ATP受體P2RX1陰性的中性粒細胞亞群浸潤增多，該中性粒細胞通過表達PDL1等免疫抑制分子介導胰腺癌肝轉移[6-7]。目前，關于P2RX1是否參與非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)的發生、發展的研究鮮有報道。NSCLC包 括 肺 鱗 癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)和肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)兩種組織類型，本研究綜合分析發現P2RX1的表達與LUAD患者預后及TME中免疫細胞的浸潤有關，為NSCLC的免疫治療提供了新的分子靶標。

1 材料與方法

1.1 研究流程圖

本研究從UCSC(http://xenabrowser.net)數據庫中下載經統一標準化的癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據集，隨后提取P2RX1基因在各個樣本中的表達數據，對數據集進行轉換后，剔除單個腫瘤小于10個樣本的數據進行預后分析，并利用R軟件包對數據集進行篩選分析，具體分析流程圖如圖1。

圖1 分析流程圖

1.2 NSCLC中P2RX1的表達水平

TIMER在線數據庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)可用于檢測腫瘤組織中免疫細胞(B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)的浸潤情況，可量化分析免疫細胞浸潤比例。利用TIMER 2.0數據庫“Diff Exp”模塊分析TCGA數據庫來源的32種癌癥中正常組織和腫瘤組織P2RX1的表達差異?；赥CGA和GTEx數據庫，利用GEPIA 2.0數據庫“Expression DIY”模塊進一步驗證P2RX1在NSCLC及其亞型中的表達。

1.3 預后分析

LinkedOmics數據庫(http://www.linkedomics.org/)包含了多種癌癥的數據和臨床信息，集成了針對TCGA數據庫的蛋白質組學樣本。GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn)同樣是基于TCGA數據庫開發而來的癌癥在線研究數據庫。在TCGA數據庫中，根據病人的ID信息查找臨床隨訪信息。本研究利用GEPIA 2.0數據庫對477例LUAD患者和480例LUSC患者進行預后分析，利用LinkedOmics數據庫進一步驗證，并分析P2RX1的表達與LUAD患者腫瘤純度(指腫瘤組織中腫瘤細胞所占的比例)、分期等臨床病理因素之間的關系。利用MethSurv數據庫(https://biit.cs.ut.ee/methsurv/)對不同甲基化CpG位點進行分析，將P2RX1甲基化模式與LUAD患者的不同臨床病理特征(民族、種族、年齡、生存等)和基因亞區域相關聯，以熱圖的形式對P2RX1中單個CpG進行聚類分析。隨后，進一步分析TCGA來源的每個CpG位點的P2RX1的甲基化水平與患者預后的關系。

1.4 富集分析

利用LinkedOmics數據庫(http://www.linkedomics.org)下載包含P2RX1表達水平的基因芯片數據集，篩選LUAD中與P2RX1正相關的前100個共表達基因。篩選UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu)中與P2RX1正相關基因的前100個，與上述LinkedOmics數據庫篩選的基因取交集，共得到79個共表達基因在兩組數據集中均存在。對此79個共表達基因進行基因本體(gene ontology，GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析。利用R軟件包“clusterProfiler”“ggplot2”“circlize”“enrichplot”等工具進行分析并繪圖。

1.5 核心基因的篩選與預后分析

STRING數據庫(https://cn.string-db.org)是分析目的基因與蛋白相互作用的在線檢索數據庫，包含已證實的和可以預測的蛋白質-蛋白質相互作用的生物數據庫和網絡資源。本研究將篩選的79個基因導入STRING在線數據庫，物種選擇類型為“Homo sapiens”，置信度選擇“Medium 0.400”，相互作用最大數選擇10，得到基因的相互作用網絡后將數據導入至Cytoscape軟件。利用Cytoscape插件“CytoHubba”挑選出與周圍基因具有高度連通性的前10個基因作為核心基因，隨后根據互相作用節點的數量進行降序排序。利用GEPIA 2.0分析核心基因在LUAD和正常肺組織中的表達差異，并分析核心基因的表達與LUAD患者總生存期(overall survival，OS)之間的關系。

1.6 P2RX1的表達與免疫浸潤的相關性

本研究利用TIMER 2.0數據庫分析P2RX1與腫瘤純度及浸潤在TME中的B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的相關性，分析經腫瘤純度校準后P2RX1與B細胞標記基因CD19、CD79A和CD79B的相關性。下載TIMER 2.0中32種癌癥的免疫細胞浸潤得分數據，利用R軟件包“estimate”、“circlize”等工具分析并可視化P2RX1與32種腫瘤中47種常見免疫檢查點、免疫和基質綜合評分(ESTIMATE Score)、免疫細胞評分(Immune Score)和基質評分(Stromal Score)之間的相關性。

1.7 統計學方法

所有統計分析均通過R3.6.3軟件進行。正常肺組織和NSCLC組織之間P2RX1的表達差異采用t檢驗。生存分析用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗分析。使用Spearman相關性檢驗分析P2RX1與免疫細胞浸潤、免疫細胞/基質評分、免疫檢查點的相關性。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P2RX1在NSCLC中低表達

TIMER 2.0數據庫顯示P2RX1在正常肺組織中的表達明顯高于LUAD和LUSC患者(圖2A)。GEPIA 2.0數據庫顯示與正常肺組織比較，P2RX1在LUAD和LUSC患者中表達下調(圖2B)。另外，與正常肺組織比較，P2RX1在近端炎癥型、近端增殖型和終末呼吸單位型3種不同LUAD亞型中的表達顯著下調(圖2C)；在基底型、經典型、原生型和分泌型4種LUSC亞型中的表達亦顯著下調(圖2D)。

圖2 P2RX1在NSCLC中的表達水平

2.2 P2RX1低表達的LUAD患者預后不良

GEPIA 2.0數據庫及LinkedOmics結果均顯示P2RX1高表達的LUAD患者OS較長(圖3A和B)，而P2RX1的表達與LUSC患者OS無明顯相關關系(P=0.099)。P2RX1的表達與LUAD患者腫瘤純度呈負相關關系(圖3C，r=-0.5402，P=1.299×10-38)，與LUAD患者的T分期(圖3D，P=3.856×10-4)、病理分期(圖3E，P=9.66×10-3)、N分期(圖3F，P=0.154×10-2)有關。

圖3 P2RX1的表達與LUAD患者預后關系

2.3 P2RX1甲基化與LUAD患者預后有關

MethSurv數 據庫顯示P2RX1中cg12709970位 點甲 基 化 水 平 較 低，而cg06475633、cg22506042、cg14116792等CpG位點甲基化水平較高(圖4A)。在這些CpG位點中，cg06475633(圖4B)和cg03368358(圖4C)甲基化水平高的患者總生存期較短，預后較差。

圖4 P2RX1中CpG位點甲基化水平

2.4 P2RX1共表達基因參與免疫調控

對LinkedOmics和UALCAN數據庫篩選的79個基因(相關系數r＞0.5，P＜0.01)進行富集分析，結果顯示這些基因主要參與B細胞受體信號通路、原發性免疫缺陷信號通路等(圖5A)；參與白細胞分化、淋巴細胞分化、T細胞激活、白細胞激活等多種生物學進程(圖5B和E)；參與構成足小體等(圖5C)；主要富集于磷脂結合、核苷三磷酸酶調控、GTP酶激活等多種分子功能(圖5D和F)。

圖5 LUAD中P2RX1共表達基因的富集分析

2.5 核心基因與LUAD患者預后有關

根據前文的篩選條件得到10個核心基因的順序依次為BTK、IKZF1、SASH3、CD79B、CD19、ZAP70、IL10RA、CD79A、WAS和CYTIP(圖6A)。利用GEPIA 2.0分析上述核心基因在LUAD中的表達，結果顯示除CD79B、CD19和CD79A外，其余7個核心基因在LUAD中的表達均顯著下調(P＜0.05，圖6B)。對核心基因進行預后分析，結果顯示除IL10RA和WAS(圖6I和K)外，其余8個核心基因低表達的患者OS均明顯縮短(圖6C～L)。

圖6 核心基因的篩選與預后分析

2.6 P2RX1與多種免疫細胞浸潤及免疫檢查點相關

TIMER 2.0數據庫顯示在LUAD中P2RX1與腫瘤純度呈顯著負相關關系，而與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞呈顯著正相關關系(P均＜0.05，圖7A)。經腫瘤純度校準后，P2RX1的表達與B細胞標記基因CD19、CD79A和CD79B呈正相關關系(P均＜0.05，圖7B～D)。

另外，本研究還發現在LUAD中P2RX1的表達與ADORA2A、BTLA、BTNL2、CD160、CD200、CD200R1、CD244、CD27、CD276、CD40等 呈 正 相 關 關 系(圖7E，P＜0.05)。

圖7 P2RX1的表達與免疫細胞浸潤及免疫檢查點的相關性分析

2.7 P2RX1與免疫/基質評分正相關

利用TIMER 2.0數據庫和R3.6.3軟件為免疫細胞/基質比例等評分并作圖，結果顯示除彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBC)、多形成性膠質細胞瘤(GBM)、急性髓細胞樣白血病(LAML)等外，其他20多種腫瘤TME中P2RX1的表達與免疫/基質評分均相關(圖8)。在LUAD中，P2RX1的表達分別與免疫和基質綜合評分(r=0.592)、免疫細胞評分(r=0.582)和基質細胞評分(r=0.513)均呈正相關(均為P＜0.05)。

圖8 32種腫瘤中P2RX1的表達與免疫基質綜合評分、免疫細胞評分及基質評分之間的關系

3 討論

嘌呤能受體X1是門控膜離子通道重要的組成部分，廣泛參與機體ATP傳遞、免疫應答、細胞增殖等生物學過程[8]。研究證實，P2RX1在人體內發揮重要的調控作用，與血小板聚集、免疫應答、細胞因子釋放以及ATP介導的細胞凋亡等過程有關[7]。本研究發現P2RX1在NSCLC不同亞型(LUAD和LUSC)中的表達顯著下調，但LUAD和LUSC兩組之間P2RX1的表達無明顯差異。高表達P2RX1的LUAD患者OS較長，預后較好，而P2RX1與LUSC患者總生存期無關。P2RX1與LUAD患者腫瘤純度呈負相關，與患者的TNM分期等有關，提示P2RX1可能在LUAD中扮演重要的抑癌因子的角色。DNA甲基化作為真核細胞正常的修飾方式，其異常在NSCLC的進展中至關重要[9]。本研究發現P2RX1多個CpG位點顯示了較高的甲基化水平，其中cg06475633和cg03368358這兩個CpG位點甲基化水平較高的患者預后較差，這一發現為后期P2RX1用于臨床診斷和治療奠定了基礎。

為了探索P2RX1在LUAD中的潛在機制和生物學功能，本研究對P2RX1共表達基因進行了富集分析。結果發現P2RX1共表達基因在免疫細胞尤其是B細胞活化、分化等生物學進程和功能中明顯富集，與機體NTP酶和GTP酶等能量代謝的調控密切相關，提示P2RX1可能通過調控TMR中的能量代謝進而影響LUAD的進展，這一發現與之前P2RX1在胰腺癌中調控免疫細胞能量代謝的作用相似[7]。P2RX1共表達基因調控網絡中的核心基因主要有BTK、IKZF1、SASH3等，它們在LUAD表達顯著下調且與LUAD預后有關，進一步提示P2RX1可能參與腫瘤微環境重塑、淋巴細胞的分化和發育等過程。

利用TIMER 2.0數據庫深入分析顯示P2RX1不僅與LUAD腫瘤純度呈負相關，而且還與不同免疫細胞尤其是與B細胞浸潤相關，與其標記基因CD19、CD79A、CD79B顯著正相關。這3個基因作為P2RX1共表達基因的蛋白互作網路中的核心基因，其低表達的LUAD患者預后不良。上述結果提示P2RX1可能參與B細胞從原細胞期分化增殖到漿細胞期的整個過程以及B細胞活化信號傳導、細胞因子釋放等過程。針對LUAD患者使用程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1/PD-L1)免疫檢查點抑制劑可誘導或增強機體抗腫瘤反應[10]。PD-1通過與其配體PD-L1和PD-L2結合進而調控T細胞增殖和免疫反應[11-13]。通過聯合使用細胞毒性T淋巴細胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)抗體和PD-1抗體可增強腫瘤浸潤淋巴細胞的增殖能力進而抑制腫瘤細胞增殖[14]。本研究發現P2RX1與CTLA-4及PD-1呈正相關，提示P2RX1可直接或間接調控CTLA-4、PD-L1等的表達進而抑制T細胞的活化，誘發抗腫瘤免疫反應。另外，P2RX1還與BTLA、LAIR、CD27等31種常見免疫檢查點顯著相關，說明P2RX1可能在TME中發揮廣泛而又復雜的免疫調控作用。在TME中，免疫細胞和基質成分是兩種主要的非腫瘤組分，對于腫瘤的診斷和預后評估具有很高的價值[15-16]。本研究發現P2RX1不僅與免疫細胞浸潤高度相關，還與腫瘤免疫/基質細胞評分呈正相關，提示P2RX1可能在免疫細胞和基質成分的動態調控過程中發揮正向調控作用。本研究不僅探索了P2RX1的表達及甲基化與LUAD患者預后的相關關系，還初步揭示了P2RX1在LUAD腫瘤微環境中參與的免疫調控作用，但本研究針對P2RX1轉錄組水平的分析尚不能解釋該分子參與的具體調控機制，關于P2RX1是否對LUAD腫瘤細胞具有調控作用也需要進一步研究證實，因此本研究需要更多的生物學實驗來驗證結論。

綜上所述，本研究發現P2RX1在LUAD中低表達與患者預后不良有關，P2RX1可能在LUAD中發揮重要的免疫調控作用，與B細胞增殖、分化等多種過程有關。對P2RX1基因進行更深層次的研究，不僅可以揭示該基因的功能，還可以進一步探索P2RX1與腫瘤發生、發展之間的關系，可為進一步探索P2RX1在LUAD中的免疫調控機制奠定基礎。