3種單劑型除草劑對糯玉米制種田雜草的防除效果及雜草解毒機制的研究

權曉康， 陸宏園， 劉家豐， 丁焓赟， 宋博文， 劇佳華， 胡偉民*

(1.浙江大學 農業與生物技術學院，浙江 杭州 310058； 2.浙江大學 農業試驗站，浙江 杭州 310058)

玉米是世界三大糧食作物之一，同時也是中國第一大糧食作物。雜草的影響是玉米生產和制種上必然存在同時危害較大的因素之一。一般在自然情況下，雜草會使玉米減產20%～30%，嚴重的可達40%以上[1]。全球范圍內主要通過使用除草劑來實現田間雜草的防除，但每年都有由于除草劑使用不當而造成玉米減產的情況發生[2]。玉米是雜交優勢明顯的作物，其親本自交系由于基因型相對純合，對生境的敏感度較大，生長勢一般劣于雜交種，其中又以甜、糯玉米自交系的敏感性更高，如果除草劑施用不當，極易造成自交系幼苗黃化、根數減少或異常，特別是在干旱缺水的情況下影響更大，黃苗和死苗數明顯增加。因此，選擇合適的除草劑及正確的施用劑量和時間是當前甜、糯玉米生產特別是制種上需要解決的問題，而目前有關除草劑對甜、糯玉米自交系種子萌發及出苗狀況影響的研究報道較少。

酰胺類、三氮苯類、硝基苯胺類除草劑是目前玉米田常用的3類除草劑，代表性單劑型除草劑分別為乙草胺、莠去津和二甲戊靈等，其作用機理和殺草譜有較大差異，并以此為基礎混配成了許多復劑，在生產上廣泛使用[3]。目前，一些商品化除草劑的作用機理還沒有被完全解釋，但是過去近40 a使用的除草劑中超過60%的化合物影響葉綠體的功能[4-5]。葉綠體中4個重要的除草劑靶標部位在除草劑分子設計和抗除草劑農作物育種基因工程中受到廣泛的重視，這4個重要的除草劑靶標為光合色素及相關組分的合成和代謝、氨的代謝及氨基酸的生物合成、脂類的生物合成及光合電子傳遞系統[6-7]；此外，除草劑對植物細胞的細胞壁也有著較大的影響[8]。而選擇性除草劑殺死雜草的主要原因是利用形態學的不同(如苯氧乙酸類除草劑)或生理上的差異(如敵稗)，也可以利用時差(如除草劑5-氯酚鈉)和位差(如除草醚)來達到除去雜草的目的[9-10]。

本文選用玉米大田生產上播后苗前常用的乙草胺、莠去津和二甲戊靈等3類單一劑型除草劑，在糯玉米制種田進行比較試驗，研究除草劑防除雜草的效果及對雜草生理生化等指標的影響，從單劑型角度探究不同除草劑對雜草的抑制表現及雜草對除草劑的拮抗機制，同時分析除草劑對自交系種子出苗和幼苗生長的影響，為糯玉米制種和自交系繁種田除草劑的選用提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 參試糯玉米自交系及試驗用除草劑品種

1.1.1 參試糯玉米自交系

參試糯玉米制種親本為浙江大學選育的4個自交系，組合1：母本N27112，父本N67111；組合2：母本N329232，父本N203312。

1.1.2 供試除草劑

供試的除草劑為目前玉米大田生產上常用的播后苗前除草劑，分別為50%乙草胺、38%莠去津、0.33 g·mL-1二甲戊靈等3種除草劑，每667 m2噴施劑量分別為100 g、90 g和180 mL，以等量清水為對照(CK)。

1.2 玉米制種田種植及除草劑防效試驗

實驗田位于浙江大學紫金港校區農業試驗站，田塊肥力均勻，地勢平坦。播種前對種植的田塊進行人工除草，以避免田塊雜草的本底影響。除草劑的噴施濃度按每667 m2各類除草劑用量兌水45 L設定，以清水為對照。試驗采用完全隨機區組設計，父母本行分別劃分小區，小區畦面寬0.9 m、長9 m，均勻單粒點播100粒種子，3次重復。2016年4月上旬選擇晴朗的天氣播種，播種后當天土壤表面噴施除草劑，施藥時間為16：00后，施藥后覆蓋地膜以防雨天影響，5 d后除去地膜。同時，為了避免或減少其他化學物質對試驗過程的干擾和影響，在種子萌發和幼苗生長過程中不噴施其他農藥。播種后20 d，統計田間出苗情況，測量苗高。

1.3 田間雜草發生情況觀察及農藝性狀統計

在噴施除草劑后，隨機截取小區中段3.6 m2進行連續跟蹤觀察，觀察時間為噴藥后20、30和40 d，共3次；分別統計雜草的種類及數目。在40 d，統計不同處理小區均有存活的主要類型雜草的農藝性狀，包括葉片數、高度、分枝數等。

1.4 光合作用及相對葉綠素含量的測定

使用SPAD-502葉綠素儀測定不同種類、不同處理雜草葉片的相對葉綠素含量；使用Li-6400光合作用測定儀(PAR=1 000 μmol·m-2·s-1，處理溫度20 ℃)測定雜草葉片凈光合速率。

1.5 還原型谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽硫-轉移酶(GST)活性的測定

1.5.1 GSH的含量測定

用硫酸緩沖液配制0.5 mg·mL-1GSH母液，分別取0、5、25、50、100、150、200、250 μL，各加入5%三氯乙酸(TCA)5 mL，分別向配好的系列標準液加入適量2-硝基苯甲酸(DTNB)顯色，20 ℃水浴5 min使其充分顯色，在412 nm下測定D值，繪制標準曲線[11]。

分別取樣品0.2 g，加入5 mL 5% TCA，在0～4 ℃下研磨，放入離心管中離心20 min(15 000g)，取部分離心后的上清液放入試管，加入pH 8.0磷酸緩沖液5 mL，再加入DTNB顯色，然后在412 nm下測定D值，通過標準曲線獲得GSH濃度。

1.5.2 GST活性測定

參照郭玉蓮等[12]方法，分別取不同處理葉片各0.2 g，加入5 mL GST酶提取液及磷酸鉀緩沖液(pH 6.5)在0～4 ℃下研磨，15 000g離心20 min，上清液為待測酶液。

取2.5 mL 3.0 mmol·L-1GSH，加入0.05 mL上述待測酶液，最后加入0.45 mL溶于96%乙醇的CDNB，340 nm反應5 min，通過計算機測定每分鐘光吸收的變化值，并通過以下公式計算GST活性。

GST活力(nmol·min-1)=(ΔD340V)/(εL)。式中ΔD340為每分鐘光吸收的變化值，V為酶促反應體積(3.0 mL)，ε為產物的消光系數(0.009 6 L·μmol-1·cm-1)，L為比色杯的光程(1 cm)。

2 結果與分析

2.1 除草劑對糯玉米自交系種子田間出苗的影響

糯玉米自交系種子播后苗前噴施除草劑20 d，不同自交系對3個單劑型除草劑的敏感性存在較大差異。分析表1正常苗比例及株高等數據可以看出，乙草胺處理后，4個自交系正常苗比例均有明顯下降，除N27112外，其他3個自交系均顯著低于對照，其中N67111正常苗株高也顯著低于對照；與對照相比，莠去津處理后，除N67111正常苗比例有所增加外，其他3個自交系均有下降，但4個自交系的正常苗比例及株高均與對照無顯著差異；二甲戊靈處理后，4個自交系正常苗比例同樣有明顯下降，其中N27112顯著低于對照，而4個自交系的株高與對照均無顯著差異。

經3種單劑型除草劑處理后，田間小區內均有一定比例的畸形苗發生，其中乙草胺處理的畸形苗比例最高，4個自交系平均達到4.6%，除N329232外，其他3個自交系均顯著高于對照；其次為二甲戊靈處理，N27112和N67111小區畸形苗比例顯著高于對照，4個自交系平均為3.5%；而莠去津處理后，4個自交系畸形苗比例與對照相比均無顯著差異(表1)。

表1 不同除草劑處理對種子田間出苗的影響

此外，從藥劑噴施后玉米葉片顏色變化來看，莠去津處理后葉片色澤濃綠，幼苗長勢較好；其次為二甲戊靈處理，幼苗長勢一般；而乙草胺處理后玉米葉片顏色偏淡，幼苗長勢偏弱。綜上所述，莠去津處理對糯玉米自交系出苗及幼苗生長的影響相對較小。

2.2 除草劑處理對田間雜草種群密度的影響

試驗期間玉米田發現主要雜草類型有12種(表2)，以禾本科雜草和闊葉雜草為主，其中馬唐、牛筋草、天藍苜蓿和空心蓮子草等數量較多。

表2 制種田主要雜草種類

從表3可以看出，供試的乙草胺、莠去津和二甲戊靈等3種除草劑對雜草的防除效果明顯，均可減少雜草的種類和數量。與對照相比，3種除草劑處理后禾本科雜草數量均顯著減少，處理后20 d，禾本科雜草分別減少了61、49和59株·m-2；處理后40 d，禾本科雜草分別減少了152、153和153株·m-2。莠去津和二甲戊靈處理20 d后，闊葉雜草分別比對照減少了29和21株·m-2；40 d，分別減少了25和26 株·m-2，說明莠去津和二甲戊靈對2類雜草具有顯著的防除效果。而乙草胺對闊葉雜草的防除效果相對較差，處理后20 d和40 d，小區內闊葉雜草數量與對照相比無顯著差異。此外，隨著時間的推移，對照小區內禾本科雜草逐漸增加，而闊葉雜草數量不斷減少，可見禾本科雜草是本次試驗田間的優勢雜草種類。

表3 田間不同類型雜草數量

表4統計了處理后田間5種主要雜草。所有處理均有空心蓮子草和碎米莎草的發生，說明空心蓮子草及碎米莎草對除草劑存在較好的抗性；另外，乙草胺處理的空心蓮子草株數顯著高于其他2個處理，因此，乙草胺在本次試驗中沒有防除空心蓮子草的效果。田間小區經除草劑處理后，僅存在空心蓮子草及碎米莎草，因此，后續只針對這2種雜草進行深入分析，以了解這2種雜草對除草劑的抗性機制。

表4 除草劑處理40 d后田間主要雜草種類及株數

2.3 除草劑處理對空心蓮子草和碎米莎草農藝性狀的影響

田間小區經莠去津與二甲戊靈處理后，空心蓮子草的一次枝梗分枝數、一次枝梗節點數、一次枝梗葉片數、一次枝梗長度均比對照顯著減少或縮短，表明這2種除草劑對空心蓮子草有較好的防除效果；而乙草胺處理與對照相比均無顯著差異，表明了乙草胺處理后對空心蓮子草的生長影響較小(表5)。

表5 不同處理小區空心蓮子草的生長情況

從表6可知，與對照相比，乙草胺能較好地抑制碎米莎草的葉齡和高度；莠去津能較好地抑制碎米莎草的高度，對碎米莎草的葉齡沒有顯著影響；二甲戊靈處理后，碎米莎草葉齡較大，但對其高度有顯著的抑制作用。

表6 不同處理小區碎米莎草的平均葉齡和高度

2.4 除草劑處理對雜草葉片光合作用及葉綠素含量的影響

2.4.1 除草劑處理對空心蓮子草光合作用的影響

與其他處理及對照相比，二甲戊靈處理后空心蓮子草凈光合速率顯著降低，說明二甲戊靈能一定程度上抑制空心蓮子草葉片的光合作用，從而影響空心蓮子草的生長；而乙草胺和莠去津處理與對照相比，凈光合效率沒有顯著差異(表5)。

2.4.2 除草劑處理對空心蓮子草和碎米莎草葉片葉綠素相對含量的影響

從表7可以看出，與其他2種除草劑相比，莠去津處理后空心蓮子草的葉綠素相對含量顯著降低，僅為20.90，比對照降低了22.40；同樣，碎米莎草的葉綠素相對含量也有明顯下降。因此，莠去津能抑制這2種雜草葉片葉綠素的合成，田間也可明顯地觀察到葉片黃化及紅化等現象，說明莠去津對空心蓮子草顯著的防除效果可能與抑制葉片葉綠素合成有關。

表7 除草劑處理后空心蓮子草和碎米莎草葉片的葉綠素相對含量

2.5 除草劑處理對空心蓮子草和碎米莎草葉片GSH含量及GST活性的影響

從表8可以看出，與對照相比，乙草胺、莠去津和二甲戊靈處理后的空心蓮子草和碎米莎草葉片的GSH含量均有明顯下降，表明這3種除草劑均能有效地抑制GSH合成；其中莠去津和二甲戊靈處理的空心蓮子草和碎米莎草葉片GSH含量均顯著下降，抑制GSH合成作用較強；而乙草胺處理的空心蓮子草葉片GSH含量與對照相比雖有所下降，但無顯著差異。

3種除草劑處理后，空心蓮子草的GST活力與對照相比有所上升，但均無顯著差異；而3個處理的碎米莎草葉片GST活力顯著上升，表明在GST活性方面，碎米莎草對于除草劑的敏感性較強(表8)。

表8 除草劑處理后空心蓮子草和碎米莎草葉片GSH含量及GST活性

3 小結與討論

本研究表明，3個單劑型除草劑均會對糯玉米自交系的出苗和幼苗生長產生不同程度的影響，而不同自交系間的抗性也存在較大差異，因此，在制種和繁種時應在預試驗的基礎上謹慎選用。其中，莠去津處理對糯玉米自交系出苗及幼苗生長的影響相對較小，正常苗和畸形苗比例、株高等與對照相比均無顯著差異，處理后葉片色澤濃綠，幼苗長勢較好。

玉米田播后苗前噴施除草劑是一種主動性的保護措施，可以有效地減少苗期雜草危害，降低人工成本。從本次試驗結果來看，供試的乙草胺、莠去津和二甲戊靈等3種除草劑對雜草的防除效果顯著，均可減少雜草的種類和數量，并能抑制雜草的生長。其中，莠去津和二甲戊靈的防效持久性明顯優于乙草胺，特別是乙草胺對空心蓮子草的防除效果較差。

為了從單劑型角度進一步了解除草劑對雜草的防除機理及雜草對除草劑的拮抗機制，本試驗進一步分析了各處理小區均存活的空心蓮子草和碎米莎草等2類雜草的農藝性狀及相關生理生化指標。結果表明，莠去津處理后，空心蓮子草葉片出現明顯的黃化和紅化現象，碎米莎草葉片同樣黃化明顯，特別是空心蓮子草葉片葉綠素含量相對顯著低于其他2種除草劑處理及對照，其除草機理可能與此有關。與對照相比，二甲戊靈處理能顯著降低空心蓮子草的光合速率，其除草機制可能與降低了葉片的光合作用有關。由于田間碎米莎草發生少，各處理小區樣本量較少，試驗結果可能會存在一定的誤差。

研究證實，雜草體內除草劑作用位點發生改變、雜草代謝解毒能力增強、雜草的屏蔽作用或與作用位點的隔離作用是雜草對除草劑產生抗性的三大主要機制[13]。本試驗分析了2種雜草的GSH含量和GST活性，結果表明，與對照相比，3種除草劑處理后，空心蓮子草和碎米莎草葉片中GSH含量下降，GST活性明顯上升。推測3種除草劑處理能夠引起抗空心蓮子草和碎米莎草等雜草GST活性上升，而GST能誘導GSH與除草劑結合，從而完成除草劑在雜草體內的降解代謝，這與前人研究結果一致[14-15]；同時也可能與GST-GSH偶聯參與除草劑解毒機制有關[16-18]。具體需要進一步從分子水平探究，以解釋和確定其內在的解毒機制。