浙江省50份甜玉米核心種質資源遺傳多樣性分析

陳曉龍， 應多， 包斐， 方瑞秋

(浙江省農業科學院 玉米與特色旱糧研究所，浙江 東陽 322100)

甜玉米作為普通玉米育種改良后的產物，不僅營養豐富，而且由于其果皮薄、口感脆甜、皮渣率低等特點，能克服普通玉米的很多缺點，起到改善人們膳食結構的作用，因此，越來越被大眾所喜愛，然而大部分的甜玉米自交系并沒有詳細系譜記載，極大地影響了后續種質改良及其雜交組合組配，使其育種效率大大降低[1]。玉米的生產模式是雜種優勢利用[2]，借助這種模式可以顯著提高鮮食玉米的品質以及產量，同時，不同雜種優勢群之間雜交后代表現出的雜種優勢存在一定差異[3]，因此，合理充分地利用甜玉米的雜種優勢就需要對雜種優勢群進行準確劃分并建立對應的雜種優勢模式[4]。

傳統的育種方式依靠田間農業性狀調查結果，對實驗的自交系類群進行表型聚類分析，其結果與系譜圖比較存在一定誤差，其可靠性仍值得商榷。但DNA分子標記技術的出現，為種質資源遺傳多樣性研究提供了新的手段。其中SSR標記由于基因組中分布廣泛、標記無功能、標記序列兩側順序較保守、共顯性遺傳以及DNA質量要求低等特性，已逐漸被育種家們廣泛使用[5]。在SSR引物的開發上，楊珊等[6]利用20份自交材料的24個SSR引物篩選出了4個對玉米耐鹽堿性相關的SSR引物。李余良等[7]從玉米基因數據庫中開發了251對SSR引物，電泳檢測出12對關于雌穗發育差異的高多態性SSR引物。在SSR引物的應用上，張微微等[8]利用篩選出的40對SSR核心引物對213份背景模糊的鮮食玉米進行遺傳多樣性分析，將213份鮮食玉米品系劃分為3大類群，其結果與自交系譜系及來源相符。

本研究利用北京農林科學院玉米研究中心研發的針對中國玉米種質開發的40對SSR核心引物對50份浙江省農業科學院玉米與特色旱糧研究所搜集的甜玉米自交系進行遺傳多樣性分析，并依據結果進行針對性地組合配對實驗，為合理挑選優良甜玉米自交系和選育新品種提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用的50份甜玉米自交系都來自于浙江省農業科學院玉米與特色旱糧研究所且都是通過多代自交純化而來，遺傳性狀良好穩定。

1.2 DNA的提取與檢測

分別取50份甜玉米自交系的籽粒10顆，在恒溫光照培養箱里恒溫培養，待生長至3葉期時，同一自交系混合取樣，液氮磨成粉末，采用CTAB法抽提DNA[9-10]，并通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000分光光度計進行檢測。

1.3 40對SSR核心引物的合成與多態性統計分析

選用的SSR引物為北京農林科學院玉米研究中心針對中國玉米種質開發的40對核心SSR標記[11-12]，引物名稱及序列見表1，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通過提取的50份甜玉米自交系DNA進行PCR擴增，產物用8.0%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，180 V恒壓電泳1.5～4.0 h，并利用銀染顯色[13]。擴增產物以“0、1、2”統計建立數據庫，在相同遷移位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，數據缺失記為“2”。標記位點的多態性信息量(PIC)按公式PIC=1-∑fi2計算，其中，fi表示某標記位點第i等位基因的基因頻率[14]。利用軟件NTsys 2.10e處理數據，并按UPGMA(unweight pair group method arithmetic averages)方法進行聚類分析。

表1 40對核心SSR標記的引物序列

2 結果與分析

2.1 SSR標記結果分析

近年來，SSR分子標記技術在B73、Mo17等骨干玉米自交系基因組序列的公布下得到了廣泛的應用[15]，截至目前，已有2 000多對玉米SSR引物發布于MaizeGDB，對所獲得的SSR引物用PCR進行擴增，再利用聚丙烯酰胺凝膠電泳，將所擴增出來的微衛星片段進行觀察比較，可清晰且高效地應用于甜玉米自交系的遺傳多樣性分析。如表2所示，40對SSR核心標記引物在50份甜玉米自交系材料中進行擴增，共檢測到228個等位基因變異，不同的SSR標記檢測到的等位基因變異為3～13個，平均為5.65個。40對SSR標記引物位點的PIC值變化范圍在0.32～0.89，平均為0.59，其中，以擴增SSR引物umc1125y3、umc1492y13和umc1231k4為例(圖1)，在聚丙烯凝膠圖中發現該SSR標記可以擴增出清晰穩定的多態性條帶。以上結果證明，實驗的SSR標記具有高度的變異性，可以較好地滿足本實驗的要求。

表2 40對核心SSR引物的等位基因與多態性信息量

A、B、C分別代表引物umc1125y3、umc1492y13和umc1231k4對部分甜玉米自交系的擴增。

2.2 50份甜玉米自交系的聚類劃分

現階段面臨的現狀是新品種的選育遺傳基礎狹窄，國內外種質資源未進行有效整理和分類，極大地抑制了種質的擴增、改良與創新[16]。因此，在育種中將擬組配用的甜玉米自交系材料先進行遺傳多樣性分析，再結合雜交優勢原理組配雜交組合，有助于更高效地選育出優良玉米品種。本研究利用NTsys 2.10e軟件計算出50份甜玉米自交系材料的遺傳相似系數，并通過UPGMA法進行聚類分析。由表3可知，在相似系數為0.57時，可將以上50份甜玉米自交系材料劃分為6大類，分別是包含33個親本的第Ⅰ大類、4個親本的第Ⅱ大類、3個親本的第Ⅲ大類、4個親本的第Ⅳ大類、5個親本的第Ⅴ大類和1個親本的第Ⅵ大類。

表3 50份甜玉米自交系聚類分析結果

2.3 優良甜玉米自交系的組合配對實驗

研究現有不同種質(品種)的遺傳多樣性，對深入剖析及挖掘優異品種的基因組成和提高育種效率具有重要的理論和實踐意義[17-18]。通過前期對實驗材料的表型鑒定，篩選出具有代表性的優質甜玉米自交系，并結合聚類劃分結果選擇親緣關系較遠的自交系進行組合配對實驗。結果如圖2，以57和59的雜交組合為例，相比于父本和母本，雜交組合F1植株更加高大、強壯，果穗籽粒數量顯著增加且更加飽滿。由表4可知，參與實驗的10組雜交組合F1在株高、穗位高、穗行數、行粒數、穗長、穗粗、莖粗等農藝性狀上都表現良好。這些結果暗示著聚類劃分能更好地輔助育種人員進行甜玉米自交系材料的選配，并結合雜種優勢在甜玉米品質、產量、抗性方面的提升作用，能更好地用于選育性狀優良的甜玉米品種。

圖2 甜玉米自交系F1雜交后代農藝性狀

表4 甜玉米自交系F1雜交后代性狀調查

3 小結與討論

3.1 甜玉米遺傳多樣性分析的意義

遺傳多樣性分析可以輔助育種家更全面地了解甜玉米種質資源的遺傳背景，是選育優良甜玉米品種的重要前提。甜玉米作為甜質型玉米亞種，籽粒含糖量高、口感脆甜，富含維生素、游離氨基酸和礦物質，是一種深受廣大消費者青睞的玉米類型。然而，我國在甜玉米育種上還存在較多問題，例如種質資源匱乏、耐熱和耐寒品種較少等[19]，極大地抑制了優質甜玉米品種的開發和應用。持續引進和鑒定出與當前主導種質遺傳距離較遠的優良新種質，是拓展種質基礎和創新種質的重要渠道[20]。因此，本研究通過40對SSR分子標記對50份甜玉米自交系分別進行了擴增，并依次利用電泳進行基因分型，然后利用UPGMA方法進行聚類分析，最終將50份甜玉米自交系材料劃分為6大類，較好地劃分了供試甜玉米自交系的遺傳背景。結合聚類劃分結果進行優良甜玉米自交系的組合配對實驗，發現雜交F1農藝性狀都表現良好，說明本研究的甜玉米遺傳多樣性分析可以快速對實驗種質資源進行歸類，確定雜交種為基礎的自交系與父母本的遺傳距離遠近，將調控優良性狀的基因高效地進行集合，對遺傳基礎方向的探索和途徑的拓展帶來極大的幫助。

3.2 SSR標記技術的特點及其存在的問題

前人研究結果表明，群體遺傳多樣性與PIC值緊密相關，即群體的平均PIC值越高，DNA標記位點變異程度越高，群體的遺傳多樣性就越豐富[21]，而PIC值的提高可以通過選擇更多的均勻分布在各個染色體上的SSR引物來實現[22]。在本研究中，40對SSR核心標記引物均勻地分布在玉米的10條染色體上，在50份甜玉米自交系材料中共檢測到228個等位基因變異，不同的SSR標記檢測到的等位基因變異為3～13個，平均為5.65個，40對SSR標記引物位點的PIC值變化范圍在0.32～0.89，平均為0.59，PIC值較高，可以較好地揭示50份甜玉米自交系的遺傳差異。分子標記的出現為遺傳多樣性分析提供了新的方法。隨著玉米基因組學的迅猛發展及分子育種實踐的持續深入，SSR標記技術將會得到快速發展與改進[23-25]。SSR標記技術的深入應用，方便了育種者從分子層次上揭示表型性狀與基因之間的關系。但是，SSR標記所面臨的問題是開發新的SSR引物投入高、難度相對較大并且在構建玉米高密度遺傳圖譜時需要引入其他的標記技術。但未來隨著科學家們對SSR標記技術運用程度的逐步加深，SSR標記技術面臨的難題將會被逐一攻破。