一種提高實驗重復性的大豆胞囊線蟲抗性鑒定方法

練云， 周揚,2， 雷晨芳， 武永康， 李海朝， 王仕偉， 王金社， 盧為國*

(1.河南省作物分子育種研究院國家大豆改良中心鄭州分中心 農業農村部黃淮海油料作物重點實驗室河南省油料作物遺傳改良重點實驗室，河南 鄭州 450002； 2.漯河市農業科學院，河南 漯河 462000)

大豆是我國主要的經濟作物之一，隨著社會經濟的發展和人們生活水平的提高，我國大豆需求量近年急劇增加。近年來，國內大豆胞囊線蟲病(soybean cyst nematode，SCN)、癥青、根腐病等病害對大豆造成嚴重減產、甚至絕產[1-3]，因此，培育抗病、優質、高產大豆品種迫在眉睫。大豆胞囊線蟲病是一種世界性大豆病害，世界范圍內各個大豆產區均有發生，伴隨近年來關于大豆產區SCN優勢生理小種致病性的升級[4-6]，具有超強致病力的大豆胞囊線蟲新小種被發現的報道[7]越來越多，應對SCN病害措施的相關研究有待加強。SCN相關研究中的抗性資源鑒定、抗病品種培育、生理小種鑒定為提出應對SCN策略提供技術支撐[1,8-10]，而以上研究均是以胞囊指數為判定依據，因此，準確、可靠的抗性鑒定方法尤其重要。盡管SCN抗性鑒定相關研究工作多是在溫室內開展，但在實際操作過程中，由于胞囊受溫度、濕度影響較大，不同重復間胞囊數目差異大仍是十分普遍的現象。基于通過控制小環境提高大豆胞囊線蟲侵染效率的抗性鑒定對SCN研究工作具有重要意義。

已有研究表明，大豆胞囊線蟲優勢生理小種出現了致病能力升級的現象，比如在2016年報道的中國大豆主產區—黃淮地區和美國密蘇里大豆產區，優勢生理小種均由1號生理小種(1號生理小種僅能侵染Riggs鑒定模式中的PI 88788)升級到了2號生理小種(2號生理小種能侵染Riggs鑒定模式中的Peking、Pickett和PI88788 3個寄主)[11]；在中國，前期還發現了具有超強致病力的新小種X12(X12小種能夠侵染目前常用的所有抗病資源)[7,12]，且大豆胞囊線蟲仍在擴散[13]。因此，亟需一套穩定的SCN抗性資源鑒定方法，篩選新抗源并將篩選到的抗源有效用于生產實踐。近年來，在SCN表型鑒定方面，取得了一定的研究進展，尤其是在計數大豆胞囊的方法方面。2005年報道了一種基于熒光成像系統的胞囊計數方法[14]，可將胞囊拍成照片，輸入電腦后在電腦上人工計數，此方法不需要在胞囊成熟一周內就完成對胞囊的計數，把人們從統計胞囊的時間限制中解脫了出來，但是不適于高通量計數；2010年報道了一種適于高通量計數胞囊的計數方法[15]，利用一種組裝、改造的熒光成像系統并配合計數軟件，實現了一次拍攝6棵植株上的胞囊并自動計數的高通量統計方法，但該機器功能單一，部分配件需特殊定制，有些配件目前市場上難以采購且市場需求量小，至今在SCN研究領域未得到推廣應用；2014年，報道了植物病蟲害表型數據采集系統[16]，此方法不需要熒光環境，直接把從根系上沖洗下來的胞囊均勻分散在黑色背景布上，利用計數軟件對普通相機拍攝的胞囊圖像計數，但是根系、沙子、蛭石、胞囊黏連等情況會影響計數結果；2018年報道了褐化大豆胞囊自動計數方法[17]，該方法適于統計褐化胞囊數目，但是在抗性鑒定及資源篩選中，多是統計褐化前處于顯囊盛期的胞囊數目。以上技術更新，均提升了胞囊數目統計的準確性及效率，已經不同程度地被應用到了大豆胞囊抗性鑒定過程中。

rhg1和Rhg4是抗SCN的2個主效位點[18-20]，借助與rhg1和Rhg4緊密連鎖的KASP標記[21-22]，在現有大豆資源中篩選到了含有SCN抗性位點且農藝性狀優良的資源[8]。開發的KASP標記不僅能從資源中篩選出來自rhg1、Rhg4位點的SCN抗性基因型信息，而且能夠從絕大部分抗性資源中區分Peking類型和PI88788類型，這些標記用于高通量分子標記輔助育種[1,8,21-22]。篩選SCN抗性種質資源主要依靠在溫室內開展表型鑒定，其中最重要的表型依據就是接種一定濃度蟲卵后，統計根系上的胞囊數目，并對待鑒定材料抗性水平進行劃分。寄生在根系中的線蟲容易受到溫度、濕度的影響，接種操作不規范、接種濃度不一致以及接種時蟲卵活性的干擾等因素都會導致抗性鑒定需要多次重復。由于諸多因素的干擾，在溫室內開展的表型抗性鑒定，勞動強度大、運行成本高，導致抗性資源篩選效率仍然比較低。目前已有的改進措施多是基于提高統計胞囊數目的準確性，目前尚未見到在抗性鑒定過程中提高大豆胞囊線蟲侵染效率、提升有效重復的表型鑒定技術。

開展SCN相關工作的研究在大環境上多利用培養室進行控溫、控濕，但在實際操作中，由于散熱性差、線蟲侵染效率不一致等小環境的影響，往往重復性差。針對溫室內由小環境引起的溫度、濕度、侵染效率不一致等引起的誤差，我們研究一種通過調控小環境和提高大豆胞囊線蟲侵染效率的抗性鑒定方法，提高接種植株間的有效重復。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與培養條件

感病材料Lee和具有不同抗性水平的大豆材料來自河南省作物分子育種研究院種質資源保存室。溫室培養條件為光照16 h/8 h(白天/黑夜)，溫度(27±1) ℃/(24±1) ℃(白天/黑夜)，濕度(70±5)%。

1.2 胞囊的繁殖

胞囊的繁殖參考練云等[5]實驗方法，將受大豆胞囊線蟲感染的病土分裝到一次性塑料杯中，移栽子葉出土期(萌發3～5 d)的Lee幼苗至病土中，每杯1株。溫室培養，適時澆水管理。

1.3 控溫改善

降低筐高：將規格為638 mm×420 mm×139 mm(內部尺寸長×寬×高)的筐改用為530 mm×341 mm×70 mm(內部尺寸長×寬×高)。加濕：在筐底部墊4 cm高的底濾網，并于光照時間在底濾網里注入0.3～0.5 cm深的水，用于光照時通過蒸發達到局部降溫，而在黑夜溫度較低時盡量使筐底部干燥，同時防止根系伸長至筐底的水中。

1.4 純化胞囊

將在病土中生長約25 d的Lee從病土中倒出，采用淘洗、過篩法依次用25目、60目、100目篩網從根系上分離胞囊，并搜集胞囊至100目篩網上。純化步驟如下：依次用100目、200目、500目篩網，用橡皮塞破碎胞囊，搜集蟲卵至500目篩網上，借助洗瓶和漏斗，將蟲卵轉移至50 mL離心管中，體積控制在20 mL以內；加等體積的40%蔗糖溶液，輕輕顛倒混勻；2 000 r·min-1離心5 min，如看到分層，則吸取中間層，棄掉上清和底部沉淀；若看不到分層，則吸取上清，棄掉底部沉淀，并將吸取的上清液在600目篩網上過濾，用流水沖洗以去除蔗糖，蟲卵留在600目篩網上；借助洗瓶和漏斗，將蟲卵轉移至燒杯中，稀釋到一定體積，混勻后取10 μL在顯微鏡下計數，即為接種液。

1.5 接種孔的孔徑改善

緊挨著待鑒定材料根系旁邊扎孔，用于注入接種液，原方法使用1 mL槍頭扎孔，本研究改用3 mm×75 mm螺絲刀或3 mm直徑的竹簽扎孔，孔的直徑是原來的1/3～1/6，接種分兩次進行，每次每株接種約1 250個蟲卵，每株兩次共接種2 500個蟲卵，兩次接種間隔24 h。

1.6 統計分析

在條件改善前后，各待鑒定植株上胞囊數目取平均值，利用方差分析不同重復間的數值，統計數值變化區間，比較條件改善前后重復實驗效果。

2 結果與分析

2.1 控溫改善

傳統方法中的筐內溫度31.9 ℃、濕度49%(圖1)，培養架表面溫度41.3 ℃、濕度28%，改進后方法(降低了筐的高度，鋪設底濾網且加水)的筐內溫度27.6 ℃、濕度68%(表1)。胞囊最佳生長條件為白天(27±1)℃，夜晚(24±1)℃，濕度70%±5%，改進后的條件更接近胞囊的最佳生長條件。

A—傳統方法的筐內溫、濕度；B—培養架表面溫、濕度；C—改進后方法的筐內溫、濕度。

表1 在不同時間點的溫、濕度比較

2.2 蔗糖梯度離心純化接種蟲卵

未經蔗糖梯度離心的蟲卵溶液中有破碎的根系、沙子、土壤等雜質(圖2)，影響計數的準確性，經過純化后的蟲卵，在4倍顯微鏡下雜質明顯減少，計數相對準確，接種到每一個待鑒定材料里的蟲卵數目一致性更高。

A—未經蔗糖梯度離心的蟲卵；B—經過蔗糖梯度離心的蟲卵。

2.3 接種孔徑改善

傳統方法中，使用1 mL的槍頭扎孔，3 000個蟲卵注入一個孔內，因槍頭上部直徑較大，扎入土內導致杯內土壤產生裂紋，接種液易擴散到遠離根系的地方，導致孵化后的幼蟲不能及時接觸到寄主；改善后，注入接種液的孔直徑是原來的1/3～1/6，由于扎孔的孔徑小，不易在扎孔時產生裂紋，而且接種液分兩次注入，每次注入一個孔內(圖3)。條件改善后有效縮小了蟲卵與根系的接觸空間，孵化后的幼蟲更容易接觸到寄主。

A—用直徑為5 mm的竹簽扎孔；B—用直徑為3 mm的螺絲刀扎孔；C—用1 mL移液器槍頭扎孔。

傳統方法中，每株一次接種3 000個蟲卵，條件改善后，每株一次接種1 500個蟲卵，接種兩次。采用分兩次接種可以減少因蟲卵活性差異或人為漏接種引起的誤差。改用螺絲刀/竹簽扎孔后，由于孔徑小，不容易注入1 mL接種物，借用1 mL槍頭輔助接種。

2.4 分離胞囊并計數

培養25 d后，將大豆植株從病土中倒出，采用淘洗、過篩法從根系中分離胞囊，利用計數軟件及體式顯微鏡，通過計算機掃描、分析，自動計數每張照片上的大豆胞囊數目，計數軟件具體使用方法見專利2018SR477328[16]。

通過以上在溫濕度、純化接種蟲卵、接種方式等方面的改善，使得每個重復實驗結果之間的胞囊數目差異較小，標準差減小(表2)。從條件優化前后接種的大豆材料Lee來看，條件優化后，標準差由133.9減小到25.1，數值變化范圍由35～347優化為102～166。條件優化后，不同重復間標準差和數值變化范圍均有較明顯變化(表1)。

表2 大豆胞囊線蟲抗性鑒定結果比較

從表2可以看出，采用改善條件后的方法使得每個重復胞囊數目一致性較好，標準差減小。其次，在鑒定過程中，利用傳統的鑒定方法，會遇到初次鑒定為中感或中抗的品種，但在重復鑒定后分別是感病或中感的現象。使用傳統方法對鑒定為中抗、中感的品種需要進行2～4次重復，對于鑒定為免疫和抗病的材料，需要進行4次或更多次重復才能下結論。采用改進后的方法，鑒定結果相對穩定，對鑒定為中感的材料一般不再重復，對鑒定為免疫、抗病、中抗的材料，根據實驗要求重復1～2次即可下結論。

依據傳統方法操作的抗性鑒定，由于參試材料重復間數值差異大，常常需要多次重復才能確定抗性。推測重復間數值差異大的可能原因是同一個品種間接種濃度不一致、溫度差異大。因此，為保證鑒定結果的準確性，每一個品種的鑒定都會重復3次以上，尤其是對于抗性材料，需在不同時間多次重復，才能下結論。這也是大豆胞囊線蟲抗性鑒定工作進展緩慢的原因之一，而經過對控溫、純化胞囊、接種方式、接種孔隙等關鍵步驟的優化，有效提高了抗性鑒定接種效率，使得重復間數值差異明顯降低。這一技術的改進對推進大豆胞囊線蟲相關研究，包括抗性資源篩選、大豆胞囊線蟲生理小種鑒定、大豆胞囊線蟲抗病基因挖掘、大豆胞囊線蟲抗病品種培育及大豆-大豆胞囊線蟲互作研究有極大的促進作用。

3 小結與討論

隨著科技進步和科研條件改善，較多單位能夠在培養室有效控制溫度和濕度，開展SCN相關研究[9,23-26]。但多年抗性鑒定結果表明，由于SCN易受溫度、濕度的影響，同一批次重復間的胞囊數目差異較大，導致SCN表型鑒定需要多次重復。Zhou等[27-28]在溫室內循環水浴條件下培養大豆胞囊線蟲，能夠較好地控制溫度，并開展大豆胞囊QTL定位研究。目前，國內還未見用循環水浴培養大豆胞囊線蟲的報道，多是在溫室培養架上進行培養，還有一些抗性鑒定是利用自然溫度在田間病圃開展，溫度、濕度較難控制。

本研究降低筐的高度，有助于散熱，保證杯子間溫度一致；墊底濾網并在筐底部加少量的水，有助于散熱，溫度可控制在光照時間(27±1)℃、夜晚時間(24±1)℃，且能夠有效避免根系通過杯子底部的孔伸長到水里，并保證濕度在70%±5%。筐的尺寸改善前，每個筐內可放6×9個杯子，每個種質材料重復3～6次；筐的尺寸改善后，每個筐內可放4×8個杯子，每個種質材料重復4次，使得設計實驗間的重復更加方便。

據了解，國內目前在SCN抗性鑒定中，室內接種條件多不經過純化，將胞囊收集，用研缽輕輕研磨把胞囊破碎后，將釋放出來的卵沖洗入燒杯內，用清水將蟲卵懸浮，取10 μL在顯微鏡下計數蟲卵密度后，直接用于接種。在直接用于接種的條件下，由于蟲卵溶液里含有砂土、蛭石、根系等殘留物，接種物比較臟，計數欠準確。經過純化程序的蟲卵，由于經過利用蔗糖梯度離心之后，去除了顯微鏡下可視的殘留物，蟲卵比較干凈，計數相對準確。另外，孔徑減小后，有效縮小了蟲卵與根系的接觸空間，孵化后的幼蟲更容易找到寄主；而且有效減小了扎孔時根系周圍出現裂紋的現象，更容易讓接種的蟲卵聚集在根系周圍，采用兩次接種可以有效避免因蟲卵活性不好或一次鑒定量大時人為漏接種導致的實驗誤差。本研究結果可以為開展SCN相關研究提供參考依據。