一株乳酸菌的分離鑒定及在香蕉飲料發酵中的應用

徐鑫龍， 郝之奎， 王震豪， 車謙， 趙鵬淵， 張杭琪， 杜樂樂， 李文潔， 王丹華， 梁金溪， 廖祥儒， 李建宋*

(1.臺州職業技術學院 應用生物技術研究所，浙江 臺州 318000； 2.江南大學生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

香蕉(Musaspp.)富含葡萄糖、果糖、果膠、纖維素、維生素及鐵、鈣等礦物質，因營養豐富、口感美好而深受眾人喜愛[1-3]。醫學研究[4]顯示，香蕉具有清熱、通便、解毒、降壓、降疲勞、緩抑郁等功效。香蕉果皮雖厚，但果實容易機械損傷、裂口或經滲透等方式被污染變腐[5]。香蕉對溫度敏感，難久藏，以香蕉為原料開發營養價值更高的發酵飲料，對促進香蕉深加工產業發展具有重要意義[6-7]。

目前，香蕉等水果的發酵多采用傳統的果蔬發酵工藝，即糖加水果的發酵方法，該方法為自然接種，有害微生物難以控制，且伴隨著亞硝酸鹽的生成，極易產生有毒物質，無法有效控制安全隱患[8]。用乳酸菌純種發酵工藝可有效降低亞硝酸鹽等有害物質的產生，顯著提高發酵產品品質[9]，篩選植物源益生菌并建立果蔬發酵工藝有著更大優勢。

本研究從美人蕉根際土壤中采集土樣，利用加入溴甲酚紫指示劑的MRS培養基篩選產酸菌株，從形態、生理生化研究和16S rRNA基因序列分析鑒定產酸菌株，以香蕉為原料利用該植物乳桿菌進行發酵工藝優化，并對香蕉發酵飲料制造的可行性進行深入探討。現將有關結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣本采自江南大學清苑門口觀賞植物美人蕉(CannaindicaL.)根部土壤5～10 cm處；香蕉來源于市場采購的新鮮香蕉；酵母粉、牛肉浸膏、胰蛋白胨及葡萄糖等試劑為普通分析純；細菌基因提取試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

主要設備有旋轉式恒溫搖床(上海蘇坤實業有限公司)、超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)、立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)、電熱恒溫鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)、紫外分光光度計(UV-2000，美國UNICO公司)、電子天平(CP214奧豪斯儀器有限公司)、XP基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)、pH計(STARTER3100，美國OHAUS公司)、數控超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)、L-800氨基酸自動分析儀(日本日立公司)、高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國安捷倫公司)和高速離心噴霧干燥機(GEA Niro公司)。

1.2 培養基

MRS培養基：葡萄糖20.0 g·L-1，酵母粉5.0 g·L-1，牛肉浸膏10.0 g·L-1，胰蛋白胨10.0 g·L-1，乙酸鈉5.0 g·L-1，檸檬酸氫二銨2.0 g·L-1，K2HPO42.0 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.58 g·L-1，MnSO4·4H2O 0.25 g·L-1，吐溫80 1 g·L-1，pH 6.2～6.6。固體MRS培養基另加瓊脂粉(1.5%)。

1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：取1.6 g溴甲酚紫加入100 mL無水乙醇中，溶解后備用。

PY基礎培養基：胰酶水解酪蛋白5.0 g·L-1，胰蛋白胨5.0 g·L-1，酵母提取物10.0 g·L-1，鹽溶液40.0 mL·L-1。鹽溶液成分：NaCl 2.0 g·L-1，無水CaCl20.2 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.48 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1，NaHCO310.0 g·L-1。

碳水化合物基礎培養基：酵母粉2.5 g·L-1，吐溫80 0.1 g·L-1，胰蛋白胨10.0 g·L-1，1.6%的溴甲酚紫乙醇溶液1.0 mL·L-1，碳水化合物溶液50 mL·L-1，調pH至6.5。碳水化合物溶液：取L-鼠李糖、海藻糖、D-半乳糖、L-山梨糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-山梨醇、D-果糖、纖維二糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、棉籽糖、肌酸、肌醇、蔗糖、麥芽糖、乳糖各10 g溶于1 L水中。

檸檬酸鹽利用培養基：脫脂奶粉10.0 g·L-1，胰酶水解酪蛋白2.5 g·L-1，葡萄糖5.0 g·L-1，瓊脂15.0 g·L-1，溶液A 10.0 mL·L-1，溶液B 10.0 mL·L-1，用藥品配制基礎培養基，調pH至6.5，115 ℃滅菌15 min后冷卻至45 ℃，然后加入溶液A和溶液B，混合均勻后倒平板，30 ℃避光干燥24 h備用。溶液A：高鐵氰化鉀10.0 g溶于100 mL蒸餾水中備用。溶液B：檸檬酸鐵1.0 g和枸櫞酸鈉1.0 g溶于40 mL蒸餾水中備用。

1.3 菌株篩選與應用

1.3.1 菌株篩選

土壤樣本采集：江南大學清苑門口觀賞植物美人蕉處，清除地表土5～10 cm后采樣，取1 g土樣置入100 mL MRS液體培養基中，30 ℃條件下在60 r·min-1的搖床中富集培養24 h。用滅菌水梯度稀釋至10-4、10-5、10-6，分別取不同梯度稀釋液100 μL涂布，于30 ℃恒溫箱倒置培養，至菌落長出。挑選黃色產酸的菌落，在含有0.15%溴甲酚紫的MRS固體培養基上進一步純化，直至獲得純培養物。

1.3.2 菌株鑒定

菌株形態學觀察。接種于MRS固體培養基上，30 ℃條件下，培養24 h后，觀察菌落和顯微特征。

菌株生理生化特征研究。參照《伯杰細菌鑒定手冊》及相關文獻[10-12]對獲得的菌株進行生理生化特性研究，以確定菌株種屬劃分。

菌株16S rRNA基因序列檢測。按照說明書提取基因組并以細菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增細菌16S rRNA基因。在50 μL反應體系中加入DNA模板1 μL，27F引物1 μL，1492R引物1 μL，2×EasyTaqPCR Supermix 25 μL，加水22 μL。95 ℃預變性5 min后，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35次循環，72 ℃延伸10 min。PCR產物利用3%瓊脂糖電泳檢測。

測序結果使用數據庫http://blast.ncbi.nlm.nih.gov研究同源性。根據比對結果，構建系統進化樹，找出與數據庫同源性最高的已知菌種，推測待定菌株可能的屬或種。

1.3.3 菌株生長特性

生長溫度的影響。使用MRS培養基、1%接種量研究溫度對菌株的影響，溫度梯度為20、25、30、35和40 ℃，60 r·min-1搖床培養，16 h后600 nm處測定吸光度(D)。

pH的影響。使用MRS培養基、1%接種量研究起始pH對菌株的影響，起始pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在30 ℃溫度條件下60 r·min-1搖床培養，116 h后600 nm處測定D。

生長曲線和產酸能力的測定。用MRS培養基、1%接種量，在30 ℃條件下60 r·min-1搖床培養，每2 h采樣并于600 nm處測定D，參照相關文獻[13]研究菌株產酸能力。

1.3.4 香蕉發酵飲料研制

工藝流程：新鮮香蕉→去皮→切片護色(0.1%檸檬酸浸泡15 min)→打漿→過濾→調配→滅菌(95 ℃，5 min)→冷卻→接種→發酵→調配→成品。

發酵條件的優化試驗。為研究水和蜂蜜的添加量對香蕉發酵飲料中氨基酸含量的影響，設計水和蜂蜜添加量兩因素進行正交試驗。香蕉∶水(V∶V)與蜂蜜量(%)分別為：樣品1，1∶1和1.0%；樣品2，1∶1和1.5%；樣品3，1∶1和2.0%；樣品4，1∶2和1.0%；樣品5，1∶2和1.5%；樣品6，1∶2和2.0%；樣品7，1∶3和1.0%；樣品8，1∶3和1.5%；樣品9，1∶3和2.0%。1%接種量，起始pH 6.5，30 ℃、60 r·min-1發酵16 h，分別測定發酵前后氨基酸含量，以確定水和蜂蜜添加量最佳配比。

氨基酸含量的測定。采樣并稱量1 mL置于安瓿管中，加入6 mol·L-1HCl 8 mL，充氮封管，用細沙包圍，120 ℃條件下水解22 h后用4.8 mL 10 mol·L-1NaOH中和，用25 mL容量瓶定容，雙層濾紙過濾，10 000g離心10 min，取400 μL上清液置入液相專用樣品瓶內，測定氨基酸含量[14]。

有機酸含量的測定。接種量1%，根據正交試驗結果確定的最佳水和蜂蜜比例構建發酵體系，30 ℃條件下發酵16 h后終止，取樣后10 000g離心5 min，測上清液有機酸含量(乙酸、乳酸、蘋果酸和檸檬酸等)，采用高效液相法[15]。

黃酮含量的測定。1)蘆丁標準曲線的制定(比色法)：0.2 mg·mL-1蘆丁標準品溶液用95%乙醇配制，移液器吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，加入1 mL 4% NaNO3溶液混勻，6 min后加入8%Al(NO3)3溶液混勻，6 min后加入10 mL 12%NaOH溶液，定容后靜置，15 min后測定D(510 nm)。蘆丁濃度作為橫坐標，D作為縱坐標，擬合標準曲線，r>99.999 8。2)黃酮含量的測定：接種量1%，根據正交試驗結果確定的最佳水和蜂蜜比例構建發酵體系，30 ℃條件下發酵16 h后終止，取5.00 mL發酵液樣品于100 mL三角瓶中，加70%乙醇25 mL，振蕩搖勻，超聲浸浴30 min，6 000g離心10 min，濾液倒入100 mL容量瓶中，20 mL 70%乙醇再浸濾渣后超聲浸浴30 min，3 000g離心5 min后取上清液，合并第一次上清液后加入70%乙醇定容至50 mL容量瓶，制成樣本備用。分別取適量發酵液，置于25 mL容量瓶中，加入1 mL 4%NaNO3溶液混勻，6 min后加入8%Al(NO3)3溶液混勻，6 min后加入10 mL 12%NaOH溶液，定容后靜置15 min，于510 nm處測定D，代入標準曲線得出的公式中，換算出樣品濃度值，計算樣品中的總黃酮含量。

香蕉飲料的感官評定。在香蕉∶水1∶2、蜂蜜添加量2.0%、接種量1%、30 ℃發酵16 h條件下，研究果葡糖漿添加量與香蕉飲料感官品質之間的關系，設果葡糖漿添加量分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%。參考國標感官評定法：邀請20位有感官評價經驗的人員，從色、香、味及狀態等方面進行評定，滿分為100分，20位評定人員平均值為最終得分。

感官評分標準：色澤，鮮明柔和，有光澤，無雜色，均勻一致，評0～20分；氣味，有清新的香蕉果香和乳酸味，無異味，評0～30分；滋味，酸甜適口，口感細膩，無不良氣味，評0～30分；組織狀態，流動性好，均勻不分層，微混濁，無雜質，評0～20分。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的鑒定

2.1.1 形態特征

菌株菌落形態如圖1所示，形狀呈圓形，中間凸起，表面光滑，直徑約3 mm，菌落細密，呈灰白色或淺黃色。顯微鏡下觀察發現，菌體為圓端直桿菌，單個、成對或短鏈狀，無鞭毛，但能運動，革蘭氏陽性，無芽孢。

圖1 Lactobacillus plantarum SYBC psL的菌落形態和顯微形態特征

2.1.2 生理生化特性

參照《伯杰細菌鑒定手冊》，初步判斷菌株為乳桿菌屬，生理生化鑒定結果見表1。

表1 Lactobacillus plantarum SYBC psL的生理生化特性

2.1.3 16S rRNA基因分析

圖2是菌株16S rRNA片段PCR擴增產物的凝膠電泳結果，在1 500 bp處出現單一熒光條帶，無明顯拖尾。測序結果BLAST比對，與植物乳桿菌Lactobacillusplantarum16S rRNA基因序列同源性達99%。結合生理生化研究結果，確定該菌株為植物乳桿菌，并命名為植物乳桿菌SYBC psL(LactobacillusplantarumSYBC psL)。

圖2 Lactobacillus plantarum SYBC psL 16S rRNA片段PCR擴增產物凝膠電泳

2.2 菌株生長特性的研究

2.2.1 適宜生長溫度和pH

研究結果(圖3～4)表明，該菌株適宜培養溫度為30 ℃，最適pH為6.5。

圖3 培養溫度對菌株生長的影響

圖4 初始pH對菌株生長的影響

2.2.2 生長曲線和產酸能力

菌株生長曲線如圖5所示，培養0～4 h為靜止期，4～12 h為指數生長期，12 h后為平衡期。菌株產酸能力較強，10 h內pH由6.5下降至4.2，對數生長期過程產酸明顯。

圖5 菌株的生長曲線和產酸能力

2.3 菌株在香蕉飲料發酵中的應用

2.3.1 發酵條件的優化

香蕉飲料發酵前后總氨基酸含量變化如圖6所示，樣品6香蕉與水比例1∶2、蜂蜜2.0%時，發酵產物中氨基酸產生量最多。發酵后8種必需氨基酸含量變化情況列于表2，表中看出：除對照外，樣品3的色氨酸最高；樣品9的色氨酸最低；樣品2的蘇氨酸最高，樣品8的蘇氨酸最低；樣品6的賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸最高；樣品2的纈氨酸最高；樣品2的甲硫氨酸最高，樣品8最低。發酵后樣品6的總氨基酸和必需氨基酸量增長最多，所以香蕉與水比例為1∶2、蜂蜜添加2.0%為最優發酵體系。

圖6 發酵前后總氨基酸含量的變化

表2 發酵后必需氨基酸含量的變化情況 單位 mg·L-1

2.3.2 有機酸含量的變化

發酵后，蘋果酸和檸檬酸含量明顯降低，乳酸含量升高，乙酸增加少許。說明發酵過程中，該菌以蘋果酸和檸檬酸為原料生產了乳酸和少量乙酸(圖7)。

圖7 發酵前后有機酸含量的變化

2.3.3 黃酮含量的變化

總黃酮含量發酵前為34.35 mg·g-1，發酵后為46.55 mg·g-1，說明經過發酵，總黃酮含量增加了35.5%。黃酮具有抗過敏、消炎等作用，能有效清除體內自由基，改善血液循環，阻止細胞衰老、退化和癌癥的發生，說明以香蕉為原料通過發酵研制的香蕉發酵飲料具有一定的營養保健價值。

2.3.4 香蕉飲料的感官評定

果葡糖漿添加量為10%時的感官評分最高，達86分(圖8)，此時產品清澈透明，呈深黃色，流動性好，酸甜度合適，口感細膩，有香蕉果香，氨基酸、乳酸和黃酮含量明顯提高。

圖8 果葡糖漿添加量對香蕉發酵飲料感官得分的影響

3 小結

本研究從美人蕉屬植物根際土壤篩選獲得一株產酸菌株，經形態特征、生理生化特征研究和16S rRNA基因序列分析，鑒定為一株植物乳桿菌，命名為LactobacillusplantarumSYBC psL；對菌株生長特性進行研究，其在溫度30 ℃、初始pH 6.5時，菌株生長最快，4 h后進入對數期，8 h生長速率達到最大，12 h左右達到穩定期；以香蕉為原料，將LactobacillusplantarumSYBC psL應用于香蕉飲料發酵，經初步研究確定當香蕉與水的比例為1∶2、蜂蜜添加量為2.0%時，氨基酸含量增長最多，乳酸和黃酮含量也明顯升高；果葡糖漿添加量為10%時產品酵素的酸甜度適口，黏度適當，具有較高穩定性。