綠色溶劑提取玉米芯黃酮的純化及活性測定

于德涵， 黎莉， 楊景淇， 曲男， 徐喆， 孫悅

(綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061)

我國是世界上玉米產(chǎn)量第二大國，每年玉米產(chǎn)量超2.5億 t，伴隨著玉米的加工，每年還有超7 000萬t的玉米芯產(chǎn)生。目前，有文獻(xiàn)報(bào)道的玉米芯應(yīng)用主要集中在作為飼料、培養(yǎng)食用菌的基料、生產(chǎn)糠醛、糖醇等的原料和發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料等幾個(gè)方面[1-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年對玉米芯的利用量不足年產(chǎn)量的20%[4]，80%以上的玉米芯都被焚燒和丟棄，不但提高了環(huán)境治理成本，還造成了極大的浪費(fèi)。

低共熔溶劑(deep eutectic solvents，DES)是一種可生物降解的環(huán)境友好型綠色溶劑，在生物活性成分的提取方面多有應(yīng)用，而且因其具有配制簡便、易于保存、安全無毒、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，漸漸有取代傳統(tǒng)提取試劑的趨勢[5]。通過前期工作，對提取玉米芯黃酮DES的組成、配比和提取條件進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)使用綠色溶劑提取玉米芯黃酮的提取量較常規(guī)有機(jī)試劑提高40%以上[5]，表現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。后續(xù)，對大孔樹脂吸附純化玉米芯黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并考察純化黃酮的抗氧化性、抑菌性和降糖能力，以期為玉米芯的綜合應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米芯(品種為先玉335)，采集于黑龍江省綏化市北林區(qū)；實(shí)驗(yàn)用菌種由綏化學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；大孔吸附樹脂購自東鴻化工有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、阿卡波糖(純度>99%)購于上海士鋒生物科技有限公司；其余試劑皆為國產(chǎn)分析純，購自南京都萊生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

752型號分光光度計(jì)：上海菁華儀器有限公司；YXQ-LS-75SⅡ型蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；JY92-IIDN型超聲波儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；HL-2型蠕動(dòng)泵，玻璃層析柱(16 mm×240 mm)：上海青浦滬西儀器廠；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；ZD-85型恒溫振蕩器：江蘇榮華儀器制造有限公司。

1.3 超聲輔助低共熔溶劑提取玉米芯黃酮和含量測定

DES制備：氯化膽堿和乙二醇(體積比1∶3)混合后加30%體積的蒸餾水，在65～80 ℃的水浴中攪拌至溶液澄明，溶液取出靜置至室溫，即為提取溶劑。

玉米芯黃酮的提取：玉米芯烘干、粉碎、過40目篩，向玉米芯粉末內(nèi)以20 mL·g-1的液料比加入DES，充分混勻后于60 ℃、135 W功率條件下超聲提取20 min。提取液冷卻后以5 000 r·min-1離心7 min，吸取上清置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮蒸發(fā)至無液體蒸出，蒸發(fā)后余液測定黃酮濃度，保存于棕色瓶中備用。

黃酮含量的測定方法和具體操作參考文獻(xiàn)[6]。

1.4 大孔吸附樹脂的選擇

分別選擇極性、孔徑等各有差異的吸附樹脂共8種參與實(shí)驗(yàn)，各大孔樹脂型號及參數(shù)特性詳見表1。

表1 大孔樹脂參數(shù)

1.5 大孔吸附樹脂的活化

將上述8種樹脂置于燒杯中，加入無水乙醇浸泡，采用傾倒法除去破損樹脂顆粒，待樹脂完全溶脹后傾出乙醇，用蒸餾水充分洗滌至樹脂無醇味，浸酸4～6 h后用蒸餾水洗至中性，再浸堿4～6 h后用蒸餾水洗至中性[7]，備用。樹脂活化所用酸、堿可使用濃度4%～5%的鹽酸和氫氧化鈉溶液。

1.6 大孔吸附樹脂的篩選和裝柱

分別將活化后的各樹脂2.0 g(濕重)置于容量為100 mL的三角瓶中，每瓶中加入10 mL提取液后用封口膜封口，在恒溫振蕩器上以30 r·min-1旋轉(zhuǎn)振搖吸附24 h。抽濾，濾液測黃酮含量，計(jì)算吸附率。樹脂用蒸餾水洗滌至溶液無色，在100 mL三角瓶中加入30 mL 70%乙醇溶液，封口后繼續(xù)振搖24 h，抽濾，測濾液黃酮含量，計(jì)算解吸率[8]。根據(jù)各樹脂的吸附率和解吸率，篩選適用樹脂。

式中：C1、C2和C3分別表示上樣液濃度、流出液濃度、洗脫液濃度，mg·mL-1；V1、V2和V3分別表示上樣液體積、流出液體積和洗脫體積，mL。

將篩選出的適用樹脂濕法裝柱，樹脂柱高16 cm，蒸餾水液面略高于樹脂柱。

1.7 玉米芯黃酮吸附純化工藝優(yōu)化

使用1.6篩選出的適用樹脂，以吸附率為評價(jià)指標(biāo)，分別改變上樣濃度(0.5～1.5 mg·mL-1，梯度為0.25 mg·mL-1)、上樣pH(2.0～6.0，梯度為1.0)和上樣速率(15～75 mL·h-1，梯度為15 mL·h-1)，考察各單因素變化對黃酮吸附效果的影響；樹脂以最優(yōu)吸附條件吸附飽和后，再分別改變洗脫過程中洗脫液濃度(乙醇濃度40%～90%，梯度10%)、洗脫液流速(60～180 mL·h-1，梯度為30 mL·h-1)和洗脫液量，以解吸率為評價(jià)指標(biāo)考察上述因素變化對吸附純化解吸效果的影響。其中，上樣流出液中黃酮?dú)堄嗔窟_(dá)到上樣液黃酮含量的10%時(shí)認(rèn)定為樹脂吸附達(dá)到飽和。

1.8 純化條件優(yōu)化效果驗(yàn)證

選擇優(yōu)化后的吸附和洗脫條件進(jìn)行玉米芯黃酮純化操作，對比純化前、后溶液純度，通過檢測兩種溶液濃度的變化計(jì)算純化倍數(shù)。

1.9 黃酮體外活性檢測

1.9.1 抗氧化能力測定

玉米芯總黃酮粗提液和純化液對·OH、DPPH和ABTS的清除能力測定參考王廣慧等[9-11]的方法進(jìn)行，使用等濃度的VC做對照。

1.9.2 抑菌活性測定

在50 mL無菌三角瓶中加入15 mL LB培養(yǎng)基，接種大腸埃希氏菌后封口膜密封，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)4 h，取出后用分光光度計(jì)測各培養(yǎng)液在600 nm波長的吸光值D600，以此為基礎(chǔ)在各三角瓶中加入一定比例的無菌蒸餾水，制成濃度相同的菌懸液。金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌懸液制備同上。

在幾支150 mL容量的三角瓶中各轉(zhuǎn)入50 mL無菌LB培養(yǎng)基，再分別加入5 mL濃度為0.1 mg·mL-1的純化黃酮和未純化黃酮，空白對照組加等量的無菌蒸餾水，再將制備好的菌懸液1 mL移入三角瓶中，封口后37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，靜置2 h后震勻，再測定各管的D600，通過空白對照組和實(shí)驗(yàn)組的D600值差值計(jì)算細(xì)菌減少的百分比，以此反映相同濃度黃酮在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)對不同細(xì)菌的抑制能力。

1.9.3 降糖活性測定

將1 mL不同濃度的黃酮粗提液與1 mL α-淀粉酶溶液加入25 mL比色管中，37 ℃水浴2 min后加入2 mL濃度為0.1%的淀粉溶液(37 ℃溫育)，混勻后在37 ℃的水浴中反應(yīng)3 min，再向比色管中加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑，混勻后移入沸水浴中顯色8 min，取出后流水冷卻至室溫，加蒸餾水至刻度，待管內(nèi)溶液顏色穩(wěn)定后用分光光度計(jì)測D540；空白對照組用等體積的磷酸緩沖液替代黃酮溶液，吸光值記為D0，阿卡波糖作陽性對照[12]，計(jì)算抑制率。替換粗提液為純化液重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性回歸方程

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測定黃酮含量，曲線回歸方程為：y=5.427 3x-0.007 2，R2=0.999 4。

2.2 大孔吸附樹脂的篩選

樹脂篩選的結(jié)果見圖1。由圖可見，在待選的8種大孔樹脂中，3種無極性樹脂和弱極性的AB-8樹脂的吸附率較大且接近，沒有顯著差異；XAD-2樹脂和D101樹脂的解吸率最高，二者差異不顯著，但顯著高于其他幾種樹脂。作為適于吸附純化的樹脂除了要有較高的吸附率之外，還要能形成可逆吸附，所以綜合來看，XAD-2樹脂和D101樹脂都適合用于玉米芯黃酮的分離純化，且二者沒有顯著差異，所以選擇這兩種樹脂進(jìn)行后續(xù)操作。

同系間無相同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，圖2～6同。

2.3 玉米芯黃酮純化工藝優(yōu)化

2.3.1 上樣液濃度對吸附率的影響

吸附條件選擇pH 5.0、流速30 mL·h-1、上樣液濃度變化同1.7節(jié)進(jìn)行操作，兩種樹脂的吸附率如圖2所示。XAD-2樹脂和D101樹脂在上樣液濃度變化時(shí)吸附率的改變是相似的，都表現(xiàn)為當(dāng)上樣液濃度不高于1.0 mg·mL-1時(shí)，吸附率一直維持在一個(gè)比較高的水平，隨著上樣濃度的加大，吸附率變化不大；再繼續(xù)加大上樣液的濃度，吸附率顯著下降。當(dāng)上樣濃度低時(shí)，兩種樹脂對上樣液中的目的物吸附較為完全，吸附率高，但是達(dá)到吸附飽和時(shí)耗時(shí)更長，效率低下；提高上樣濃度后，溶液中雜質(zhì)含量也增加，導(dǎo)致雜質(zhì)和黃酮之間吸附競爭增大，阻礙黃酮被吸附，吸附率隨之降低，所以1 mg·mL-1是最佳上樣液濃度。

圖2 上樣液濃度對吸附率的影響

2.3.2 上樣液pH對吸附率的影響

選擇上樣濃度和流速分別為1.0 mg·mL-1和30 mL·h-1，上樣液pH梯度變化同1.7節(jié)所述，吸附率結(jié)果見圖3。pH 4.0時(shí)XAD-2樹脂吸附率最高，為75.1%，而D101樹脂吸附率略低于此值，但差異不顯著；偏離此pH兩種樹脂的吸附率都會(huì)下降。黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中多含有酚羥基，在堿性溶液中的溶解性會(huì)增大，所以pH高于4.0時(shí)，弱酸近中性環(huán)境有利于黃酮中酚羥基的解離，溶劑和黃酮之間加強(qiáng)的作用力會(huì)抑制吸附；另外，黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中還含有酮式羰基，該結(jié)構(gòu)會(huì)在低pH環(huán)境下成鹽，所以pH過低時(shí)吸附率下降。故選擇4.0為最優(yōu)pH值。

圖3 上樣液pH對吸附率的影響

2.3.3 上樣流速對吸附率的影響

設(shè)置上樣液流速梯度變化同1.7節(jié)所述、pH 4.0、濃度1.0 mg·mL-1，考察吸附效果最理想的上樣流速(圖4)。上樣流速對兩種樹脂的吸附率都影響顯著。上樣流速越慢，吸附液在層析柱中停留時(shí)間越長，黃酮有充分的時(shí)間擴(kuò)散到樹脂內(nèi)部，吸附越充分，吸附率高，但操作時(shí)間會(huì)相對延長；上樣流速快，會(huì)縮短吸附操作時(shí)間、提高效率，但黃酮在層析柱中停留時(shí)間縮短會(huì)導(dǎo)致吸附率隨著流速增加顯著下降。通過對效率和效果的綜合考量，上樣流速為15 mL·h-1最佳。

圖4 上樣流速對吸附率的影響

2.3.4 洗脫液濃度對解吸率的影響

XAD-2樹脂和D101樹脂分別以pH 4.0、濃度1 mg·mL-1、流速15 mL·h-1的上樣條件進(jìn)行吸附至飽和，用濃度梯度同1.7節(jié)所述的乙醇溶液60 mL，以90 mL·h-1的速率進(jìn)行洗脫，解吸率結(jié)果如圖5。兩種樹脂都是在乙醇濃度為70%時(shí)解吸率最高，且沒有顯著差異；一旦偏離這個(gè)濃度，解吸率就會(huì)顯著下降，而且偏離越遠(yuǎn)，解吸率越低。造成此現(xiàn)象的原因是玉米芯黃酮的極性和70%乙醇的極性相同，所以在70%乙醇中溶解性最好，容易被該溶液從樹脂上洗脫下來，解吸率大；而與70%乙醇濃度差距越大的洗脫液，極性與玉米芯黃酮極性相差越遠(yuǎn)，溶解性越差，所以洗脫效率更低。故70%乙醇溶液洗脫效果最佳。

圖5 洗脫液濃度對解吸率的影響

2.3.5 洗脫液流速對解吸率的影響

分別使用60 mL 70%乙醇采用1.7節(jié)所述的梯度流速進(jìn)行洗脫，對解吸率影響見圖6。兩種樹脂的解吸率都隨著洗脫液流速的升高而顯著降低，即二者都是在60 mL·h-1的流速下解吸率最高，但二者之間沒有顯著差異。造成這種結(jié)果的原因是洗脫液流速慢時(shí)，洗脫液能和吸附物充分接觸并將其溶解，有助于吸附物和樹脂分離，能夠充分洗脫；而洗脫液流速加快后，情況相反，樹脂中吸附殘留成分多，導(dǎo)致解吸率降低。所以洗脫流速選擇60 mL·h-1為佳。

圖6 洗脫液流速對解吸率的影響

2.3.6 洗脫液體積對解吸率的影響

樹脂吸附飽和后，用100 mL 70%乙醇以60 mL·h-1的速度進(jìn)行洗脫，洗脫液每10 mL收集一管，分別計(jì)算各管的解吸率，結(jié)果如圖7所示。兩種樹脂使用同等體積的洗脫液進(jìn)行洗脫時(shí)，XAD-2樹脂前期洗脫速度快，后期趨于平緩，第6管洗脫液中黃酮的測量值已經(jīng)極低，即該樹脂使用60 mL洗脫液基本可以完成洗脫；D101樹脂的前期洗脫速率相較于XAD-2樹脂來說較為平緩，所需的總洗脫液量也稍多。綜合來看，兩種樹脂都選擇70 mL洗脫液可以完全洗脫。

圖7 洗脫液用量對解吸率的影響

2.4 玉米芯黃酮純化結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別選擇XAD-2樹脂和D101樹脂，將pH 4.0、濃度1 mg·L-1的上樣液以15 mL·h-1的速度流經(jīng)二者吸附至飽和，再用流速為60 mL·h-1的70%乙醇70 mL進(jìn)行洗脫。經(jīng)計(jì)算，通過XAD-2和D101樹脂純化的玉米芯黃酮純化液純度為粗提液純度的2.05倍和1.94倍，說明上述條件下，這兩種樹脂都可用于純化玉米芯黃酮，且純化效果良好。

2.5 體外活性測定

2.5.1 黃酮的抗氧化性檢測

分別用XAD-2樹脂純化液、D101樹脂純化液和未經(jīng)純化的黃酮粗提液對OH、DPPH和ABTS作用，各清除率見圖8。測試濃度范圍內(nèi)的黃酮對3種自由基的清除能力與其濃度正相關(guān)，且該能力在黃酮純化后被增強(qiáng)，故純化操作能強(qiáng)化玉米芯黃酮成分的抗氧化性；兩種不同樹脂純化后的黃酮在對3種自由基的清除能力方面無明顯差異，但都明顯弱于VC。

圖8 玉米芯黃酮的自由基清除能力

2.5.2 黃酮的抗菌能力測定

玉米芯黃酮純化前、后對實(shí)驗(yàn)用3種細(xì)菌的抑制能力結(jié)果見表2。3種玉米芯黃酮溶液的抑菌率可知，玉米芯黃酮對大腸埃希氏菌的抑制作用最強(qiáng)、對枯草芽孢桿菌最弱；純化操作對玉米芯黃酮的抗菌性提升有益，但未見對枯草芽孢桿菌的抑制作用有顯著增強(qiáng)。

表2 固定濃度黃酮的抑菌效果

2.5.3 黃酮的降糖活性測定

不同濃度的黃酮對α-淀粉酶的抑制能力如圖9所示。黃酮的降糖性隨著濃度的增加而加強(qiáng)，純化黃酮的降糖能力明顯高于未純化樣品而稍低于對照品阿卡波糖，濃度升高時(shí)，純化黃酮的降糖性更為接近阿卡波糖。

圖9 玉米芯黃酮對α-淀粉酶的抑制作用

3 小結(jié)

本文主要對DES提取的玉米芯黃酮的純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并探討了黃酮的體外活性XAD-2和D101樹脂在對玉米芯黃酮的吸附率和洗脫率方面沒有明顯差異，且在8種待選樹脂中效果最佳，皆可作為其純化的吸附介質(zhì)；經(jīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)篩選出的最優(yōu)吸附純化條件為：二樹脂將濃度1 mg·mL-1、pH 4.0的待吸附液以15 mL·h-1速度上樣，飽和后用70 mL 70%的乙醇以60 mL·h-1的流速洗脫，可分別將玉米芯黃酮純化2.05和1.94倍；玉米芯黃酮表現(xiàn)出具有清除·OH、DPPH和ABTS能力的抗氧化性，無論純化與否，抗氧化性皆與黃酮濃度正相關(guān)，而純化會(huì)強(qiáng)化該性能；固定濃度的玉米芯黃酮有抑菌作用，其對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌抑制作用強(qiáng)于枯草芽孢桿菌，且純化會(huì)加強(qiáng)對前兩種細(xì)菌的抑制；體外降糖實(shí)驗(yàn)表明，玉米芯黃酮對α-淀粉酶的抑制作用隨濃度加大而增強(qiáng)，較高濃度的純化黃酮有接近阿卡波糖的降糖效果。

經(jīng)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)論可知，DES提取的玉米芯總黃酮可采用XAD-2大孔樹脂和D101大孔樹脂純化，兩種樹脂純化效果相當(dāng)，工藝可行。