葡萄阿薩伊果混合飲料對脂多糖誘導(dǎo)斑馬魚炎癥模型的保護(hù)作用

扈曉佳， 董思萱

(自然陽光(上海)日用品有限公司， 上海 200070)

葡萄(Vitisvinifera)是世界上栽培面積最廣的果樹作物，也是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的作物。葡萄富含礦物質(zhì)、維生素及人體所需的氨基酸，隨著生物科技的發(fā)展，從葡萄中還相繼發(fā)現(xiàn)了多種具有抗氧化、消炎的天然活性物質(zhì)，如白藜蘆醇、齊墩果酸、花色苷和原花青素等，具有極高的保健價(jià)值[1]。阿薩伊果又稱巴西莓，是產(chǎn)于亞馬遜雨林地區(qū)的一種棕櫚樹的果實(shí)，于2013年被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品[2-4]。阿薩伊果含有的原花青素二聚體成分，能有效地抑制胰脂活性酶的活性，對人體具有降血脂的功效，幫助人體預(yù)防心腦血管疾病[5]。葡萄阿薩伊果混合飲料是自然陽光旗下的天然健康飲品，飲料中的水果精華萃取于阿薩伊果、白葡萄、紅葡萄、藍(lán)莓、蔓越莓等水果，含有人體健康所需的花青素、不飽和脂肪酸、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)。其主要功能物質(zhì)包含花青素及原花青素糖苷類、黃酮類物質(zhì)[6-8]，具有抗菌、抗氧化、消炎、抗疲勞、保護(hù)肝臟等多種藥理作用[9-11]。目前對葡萄阿薩伊果混合飲料抗炎活性的研究報(bào)道仍較少。

斑馬魚作為一種新的模式動物，具有體積小、費(fèi)用低、實(shí)驗(yàn)周期短的特點(diǎn)[12]。目前在食品、活性部位篩選、安全性評價(jià)以及藥物代謝等中藥相關(guān)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛。脂多糖(LPS)是所有革蘭氏陰性菌的主要外膜成分，可激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞。斑馬魚受到LPS刺激后，啟動一系列細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致中性粒細(xì)胞活化并釋放促炎細(xì)胞因子[13-15]。本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖誘導(dǎo)法構(gòu)建斑馬魚炎癥模型，研究葡萄阿薩伊果混合飲料的最大檢測濃度及抗炎活性評價(jià)，以期為葡萄阿薩伊果混合飲料的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

受精后3 d的轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚450尾，由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)育中心(實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號為SYXK(浙)2021-0171)繁殖提供。葡萄阿薩伊果混合飲料由自然陽光(上海)日用品有限公司提供。吲哚美辛(批號：1108939)購自上海晶純實(shí)業(yè)有限公司。LPS(批號：12180309)購自Sigma公司。

解剖顯微鏡(SZX7，OLYMPUS，日本)，CCD相機(jī)(VertA1，上海土森視覺科技有限公司)，精密電子天平(CP214，OHAUS，美國)，電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡(AZ100，Nikon，日本)，甲基纖維素(Sigma，美國)，6孔板(Nest Biotech)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄阿薩伊果混合飲料最大檢測濃度

將6孔板中330尾轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚隨機(jī)分為11組，包括正常對照組、模型對照組、9個(gè)不同濃度葡萄阿薩伊果混合飲料實(shí)驗(yàn)組，每組30尾。正常對照組為養(yǎng)育用水處理斑馬魚，模型對照組和實(shí)驗(yàn)組則為用LPS以卵黃囊注射方式處理斑馬魚，建立斑馬魚炎癥模型。模型建立成功后，實(shí)驗(yàn)組給予系列濃度(3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250、500和1 000 μL·mL-1)的葡萄阿薩伊果混合飲料，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，考察葡萄阿薩伊果混合飲料不同濃度組的斑馬魚的死亡數(shù)量，確定葡萄阿薩伊果混合飲料最大檢測濃度。

1.2.2 葡萄阿薩伊果混合飲料的抗炎作用

將6孔板中120尾斑馬魚隨機(jī)分為4組，包括正常對照組、模型對照組、吲哚美辛組和葡萄阿薩伊果混合飲料組，每孔每組30尾。模型建立成功后，陽性對照組給予80 μmol·L-1的吲哚美辛，實(shí)驗(yàn)組給予15.6 μL·mL-1的葡萄阿薩伊果混合飲料。將各組斑馬魚置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，每組隨機(jī)選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算斑馬魚炎癥中性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)。以斑馬魚炎癥中性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)評價(jià)葡萄阿薩伊果混合飲料對LPS誘發(fā)斑馬魚模型的抗炎活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄阿薩伊果混合飲料最大耐受劑量的確定

在進(jìn)行功效評價(jià)之前，考察斑馬魚對不同濃度的葡萄阿薩伊果混合飲料的最大耐受劑量。葡萄阿薩伊果混合飲料在3.9～15.6 μL·mL-1濃度時(shí)，斑馬魚無死亡現(xiàn)象，也無明顯形態(tài)行為異常和毒副作用。在31.25 μL·mL-1濃度時(shí)，6.67%(2/30尾)斑馬魚被誘發(fā)心包水腫，10%(3/30尾)斑馬魚出現(xiàn)身體彎曲現(xiàn)象。在62.5～1 000 μL·mL-1濃度范圍內(nèi)，葡萄阿薩伊果混合飲料誘發(fā)100%(30/30尾)斑馬魚死亡。因此，后續(xù)的功效評價(jià)中，葡萄阿薩伊果混合飲料的最佳實(shí)驗(yàn)濃度確定為15.6 μL·mL-1(表1)。

表1 斑馬魚對不同濃度葡萄阿薩伊果混合飲料的耐受情況

2.2 葡萄阿薩伊果混合飲料抗炎作用評價(jià)

葡萄阿薩伊果混合飲料對中性粒細(xì)胞在斑馬魚尾鰭傷口處聚集的影響如圖1和表2所示。模型對照組斑馬魚炎癥部位中性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)(16)與正常對照組(3)相比顯著上升，而吲哚美辛組(80 μmol·L-1吲哚美辛)斑馬魚中性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)與模型對照組比較顯著下降(圖2)，表明LPS誘發(fā)轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建成功，同時(shí)也說明陽性藥吲哚美辛對斑馬魚中性粒細(xì)胞的聚集有顯著的抑制作用。葡萄阿薩伊果混合飲料濃度為15.6 μL·mL-1時(shí)，所對應(yīng)的斑馬魚尾鰭部位中性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)為9，與模型對照組的細(xì)胞個(gè)數(shù)(16)相比顯著減少，炎癥消退作用為44%，略優(yōu)于陽性藥吲哚美辛組(38%)(圖3)。

***表示與模型對照組相比P<0.001。圖3 同。

圖3 葡萄阿薩伊果混合飲料組與吲哚美辛組對斑馬魚炎癥消退作用比較

表2 葡萄阿薩伊果混合飲料對斑馬魚的炎癥保護(hù)作用

圖1 各組斑馬魚炎癥部位中性粒細(xì)胞聚集情況(紅色區(qū)域?yàn)檠装Y部位中性粒細(xì)胞)

3 小結(jié)與結(jié)論

炎癥是機(jī)體對外來生物的一系列綜合生理反應(yīng)，包括人類病原體、灰塵顆粒和病毒等，是機(jī)體清除病原體和組織修復(fù)的一部分[16]。當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)會產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)，包括趨化因子、細(xì)胞因子、血管活性胺、類二十烷酸和蛋白水解級聯(lián)產(chǎn)物，從而在局部引發(fā)炎癥滲出物[17]。此時(shí)，血管中的血漿蛋白和白細(xì)胞(主要是中性粒細(xì)胞)可以通過毛細(xì)血管后小靜脈進(jìn)入血管外組織，向炎癥部位遷移和聚集[18]，當(dāng)它們到達(dá)受影響的組織部位時(shí)，中性粒細(xì)胞通過與病原體的直接接觸或通過組織駐留細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的作用而被激活[19]。激活的中性粒細(xì)胞試圖通過釋放有毒成分來殺死病原體，這些成分包括活性氧和蛋白酶3、組織蛋白酶G和彈性蛋白酶[20]。研究表明，機(jī)體內(nèi)的病理過程大多與ROS的過量產(chǎn)生有關(guān)，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷或炎癥發(fā)生[21]。因此，中性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)增多表明炎癥反應(yīng)和炎癥浸潤的發(fā)生，是評價(jià)藥物抗炎作用的重要指標(biāo)[22]。

有研究表明，葡萄和阿薩伊果中含有多種抗氧化成分，如花青素、黃酮和酚類成分，具有抗炎、抗氧化、抗高血壓和降糖降脂等多種生物活性[23-27]。Kim等[28]使用阿薩伊果提取物處理LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)阿薩伊果可以抑制IL-6、IL-8和PGE 2等細(xì)胞因子表達(dá)，從而控制炎癥反應(yīng)。Kang等[29]從阿薩伊果中分離了5種黃酮類化合物，發(fā)現(xiàn)其具有抑制NF-kB活化的抗炎作用。Carey等[30]通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，阿薩伊果干預(yù)后可以降低大鼠體內(nèi)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞一氧化氮和腫瘤壞死因子-α的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，阿薩伊果可以抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制一氧化氮合成、抑制NF-kB有關(guān)[28]。

斑馬魚因其體積小、繁殖力高和基因組注釋完整等優(yōu)勢，成為最受重視的脊椎動物發(fā)育生物學(xué)模式動物之一，也是目前唯一適合進(jìn)行微孔板高通量藥物篩選的脊椎類動物[31]。斑馬魚幼蟲的透明度允許炎癥細(xì)胞遷移的實(shí)時(shí)可視化，在炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，斑馬魚的主要白細(xì)胞是中性粒細(xì)胞，它們是最豐富的，也是最先到達(dá)受傷部位的細(xì)胞[32]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用了轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚，可在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚體內(nèi)的中性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)，直觀展示斑馬魚體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

本研究基于LPS誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞斑馬魚炎癥模型，發(fā)現(xiàn)15.6 μL·mL-1自然陽光葡萄阿薩伊果混合飲料對斑馬魚無明顯毒副作用，同時(shí)可以抑制LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞浸潤，發(fā)揮抗炎作用。結(jié)果顯示，斑馬魚模型中自然陽光葡萄阿薩伊果混合飲料組的炎癥應(yīng)激反應(yīng)較模型組顯著降低，效果略優(yōu)于陽性對照組。本研究通過斑馬魚炎癥模型驗(yàn)證了葡萄阿薩伊果混合飲料的抗炎活性，為葡萄阿薩伊果混合飲料的研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。