冬凌草甲素逆轉乳腺癌MCF-7細胞對氟維司群耐藥的機制研究Δ

胡高波，朱瑞，金湛，魏自太#（.衢州職業技術學院醫學院，浙江 衢州 34000；.浙江中醫藥大學藥學院，杭州 30053）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率和病死率高[1]。據WHO國際癌癥研究機構數據顯示，2020年乳腺癌全球新發226萬例，占新發癌癥病例的11.7%，成為全球第一大癌癥。中國是乳腺癌大國，2020年新發乳腺癌約42萬例，并導致近12萬人死亡[2]。化療仍是目前治療乳腺癌的主要方式，其在縮小病灶、減少手術造成的傷殘、提高乳腺癌患者生存率等方面具有較大優勢[3]，但耐藥性是無法避免的現實問題[4]。氟維司群（fulvestrant，Ful）作為治療乳腺癌的一種新型抗雌激素藥物[5]，其耐藥性問題仍是急需突破的瓶頸[6－8]。

冬凌草甲素（oridonin，Ori）是從冬凌草植物中提取的二萜類化合物，具有良好的抗腫瘤活性，對白血病細胞、胃癌細胞的耐藥性具有較好的逆轉作用[9－11]。相關研究表明，通過調控磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）信號通路，可以達到逆轉腫瘤耐藥性的效果[12]。本團隊前期通過研究證明Ori可能通過誘導乳腺癌MCF-7/Ful細胞產生DNA損傷，引起細胞凋亡、細胞周期阻滯及細胞自噬，從而逆轉乳腺癌MCF-7細胞對Ful的耐藥[13]。因此，本研究擬通過檢測PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達，以及裸鼠腫瘤質量和體積的變化，進一步探討Ori逆轉乳腺癌MCF-7細胞對Ful耐藥的機制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括BB150型CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）、TDL-4型低速離心機（浙江納德科學儀器有限公司）、Mini-PROTEAN型電泳儀（美國Bio-Rad公司）、ChemiScope 6200 Touch型化學發光成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司）、FA1004N型電子天平（上海儀天科學儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑包括Ori對照品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%），Ful對照品（美國Sigma公司，純度≥98%），DMEM培養液、胎牛血清（美國Hyclone公司），MTT（北京索萊寶科技有限公司，批號1021C018），BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號P0032），兔源PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（美國CST公司），青霉素、鏈霉素（杭州吉諾生物醫藥技術有限公司）等。

1.3 細胞與動物

人乳腺癌MCF-7細胞株購自中國科學院上海細胞庫。SPF級BALB/c裸鼠，4周齡，雄性，體質量20～25 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產合格證號為SCXK（滬）2017-0009，飼養于浙江中醫藥大學實驗動物中心。本研究經衢州職業技術學院醫學院動物倫理中心審批通過，倫理號：20191209-09。

2 方法

2.1 Ori體外逆轉乳腺癌MCF-7細胞對Ful耐藥機制的驗證

2.1.1 耐藥細胞誘導及培養 將不耐藥的正常乳腺癌MCF-7細胞培養于含10%胎牛血清、200 U/mL青霉素、200 U/mL鏈霉素的DMEM培養液中，并于培養液中加入Ful，壓力（Ful濃度為1 μmol/L）篩選12個月，誘導細胞耐藥。然后調整Ful劑量為0.5 μmol/L，置于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養至對數生長期，即得對Ful耐藥的乳腺癌MCF-7/Ful細胞，用于后續實驗。藥物劑量參考文獻[13]和前期預實驗結果設置。

2.1.2 MCF-7和MCF-7/Ful細胞相對細胞活力檢測 采用MTT法進行檢測。取對數生長期的正常MCF-7細胞及“2.1.1”項下MCF-7/Ful細胞，接種至96孔板中，每孔3 000個細胞。將細胞置于37℃、5%CO2培養箱中培養過夜，待細胞完全貼壁后，根據預實驗結果，每孔加入不同濃度[0（對照）、0.1、1、10、20、50 μmol/L]的Ful，每個濃度設置4個復孔；另設空白培養基組，藥物劑量參考文獻[13]和前期預實驗結果設置。藥物作用48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續培養4 h后，每孔再加入三聯裂解液（鹽酸+十二烷基硫酸鈉+異丙醇）200 μL，于37℃恒溫培養箱中放置18 h后，使用酶標儀在570 nm波長處測定各孔的光密度（OD），并計算相對細胞活力。相對細胞活力（%）＝（實驗組OD570－空白培養基組OD570）/（對照組OD570－空白培養基組OD570）×100%。實驗重復3次。

2.1.3 MCF-7/Ful細胞抑制率及聯合指數檢測 采用MTT法進行檢測。取“2.1.1”項下MCF-7/Ful細胞，接種至96孔板中，每孔3 000個細胞。待細胞貼壁后，用不同濃度的Ori[0（對照）、5、10 μmol/L]和Ful[0（對照）、4、8、12、16、20 μmol/L]單獨及聯合使用處理細胞48 h，每個濃度設置4個復孔。藥物劑量依據前期預實驗結果設置。每孔加入MTT溶液20 μL，培養4 h后，再加入三聯裂解液（鹽酸+十二烷基硫酸鈉+異丙醇）200 μL，繼續放置18 h后，使用酶標儀在570 nm波長處測定OD，并計算細胞抑制率。細胞抑制率（%）＝（對照組OD570－實驗組 OD570）/對照組 OD570×100%，實驗重復 3 次。采用CompuSyn軟件繪制不同聯合效應下的抑制率-聯合指數關系圖，計算不同劑量組合下的聯合指數。

2.1.4 MCF-7/Ful細胞中PI3K/Akt信號通路相關蛋白的檢測 采用Western blot法進行檢測。取“2.1.1”項下MCF-7/Ful細胞接種至6孔板中，每孔6×105個細胞。將細胞隨機分為空白對照組、Ful組（5 μmol/L）、Ori組（8 μmol/L）、Ful（5 μmol/L）+Ori（8 μmol/L）組，每組設置4個復孔。待細胞貼壁后，按上述分組加入相應的藥物或磷酸鹽緩沖液。藥物劑量依據前期預實驗結果設置。作用24 h后加入RIPA裂解液，于冰上裂解30 min后離心（3 000 r/min，5 min），取上清液，凝膠電泳分離總蛋白。電壓開始設置為80 V，當蛋白樣品進入分離膠后，電壓提高到120 V，參照預染Marker的位置，待目的條帶進入凝膠最佳分離區時，停止電泳。在凝膠上面鋪上經甲醇和轉膜液浸濕的PVDF膜，在PVDF膜上再放3層浸過轉膜液的濾紙，放上第2塊海綿墊，放入轉移槽中，槽中灌滿轉膜液，打開電源，穩流200 mA（120 min）。轉膜結束后，取出PVDF膜并做好標記，用TBST洗膜10 min×3次。將PVDF膜放入孵育盒中，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩1.5～2.0 h；封閉結束后，用TBST洗膜10 min×3次。加入p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GAPDH一抗（稀釋度均為1∶1 000），4℃孵育過夜；洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1∶2 000），室溫孵育2 h，顯影。采用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析，以PI3K、Akt蛋白與內參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目標蛋白的表達水平，以p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值分別表示PI3K、Akt的磷酸化水平。

2.2 Ori體內逆轉乳腺癌MCF-7細胞對Ful耐藥機制的驗證

采用裸鼠移植瘤模型進行體內實驗驗證。將裸鼠隨機分為空白對照組、Ful組（80 μmol/g）、Ori組（50 μmol/g）、Ful（80 μmol/g）+Ori（50 μmol/g）組，每組8只，分籠飼養。藥物劑量由前期預實驗結果確定。取“2.1.1”項下MCF-7/Ful細胞，胰酶消化后，用生理鹽水調整細胞密度為1×107個/mL，以每只裸鼠0.2 mL接種于裸鼠背部皮下，觀察移植瘤的生長情況。待腫瘤生長至100 mm3左右時，按分組腹腔注射相應的藥物或磷酸鹽緩沖液，每4天1次，每次注射前用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，持續28 d。腫瘤體積＝1/2長徑×2倍短徑。給藥結束后采用CO2處死裸鼠，解剖裸鼠取出腫瘤，稱量腫瘤質量，計算抑瘤率。抑瘤率（%）＝[（空白對照組腫瘤質量－給藥組腫瘤質量）/空白對照組腫瘤質量]×100%。

2.3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1MCF-7和MCF-7/Ful細胞相對細胞活力的檢測結果

MTT法檢測結果顯示，Ful能夠不同程度地抑制MCF-7和MCF-7/Ful細胞增殖，且具有劑量依賴趨勢。當Ful≥10 μmol/L時，MCF-7/Ful細胞的相對細胞活力顯著高于MCF-7細胞（P＜0.05），結果見圖1。在Ful作用下，MCF-7/Ful細胞活力越大，代表其耐藥性越強。

圖1 Ful作用下MCF-7和MCF-7/Ful細胞的相對細胞活力折線圖

3.2Ori對MCF-7/Ful細胞抑制率的影響及聯合指數結果

MTT法檢測結果顯示，Ori能夠對MCF-7/Ful細胞產生抑制，且具有劑量依賴趨勢。當Ori和Ful聯合使用時，與兩者相應劑量單獨使用時對比，MCF-7/Ful細胞的抑制率均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），結果見表1。結果表明，Ori能夠逆轉乳腺癌MCF-7細胞對Ful的耐藥，且與Ful聯合使用后，逆轉耐藥效果更強。通過CompuSyn軟件繪制得到抑制率-聯合指數關系圖（圖2）。如圖2所示，各劑量組聯合指數均在橫線下方，即聯合指數均小于1，具有協同作用[14]。當Ori劑量為5 μmol/L、Ful劑量為8 μmol/L時，聯合指數最小。

表1 乳腺癌MCF-7/Ful細胞抑制率（±s，n＝4）

表1 乳腺癌MCF-7/Ful細胞抑制率（±s，n＝4）

a：與相應劑量Ful單獨使用比較，P＜0.05；b：與相應劑量Ori單獨使用比較，P＜0.05；c：與相應劑量Ori單獨使用比較，P＜0.01

Ful 20 μmol/L 42.12±5.69 60.63±5.41ac 71.69±6.56ac Ori/（μmol/L）0 5 1 0 Ful 0 μmol/L 0 17.32±3.23 31.64±4.23 Ful 4 μmol/L 14.23±1.32 32.36±2.36ab 39.69±5.12ab Ful 8 μmol/L 28.31±2.36 55.32±5.63ac 59.69±5.98ab Ful 16 μmol/L 35.1±4.23 59.21±5.12ac 69.32±6.12ab

圖2 Ful和Ori聯合使用的抑制率-聯合指數關系圖

3.3 Ori對乳腺癌MCF-7/Ful細胞中PI3K/Akt信號通路的影響

與空白對照組比較，Ori組和Ful+Ori組細胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值及Ful組細胞中p-PI3K/PI3K比值均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與Ful組比較，Ful+Ori組細胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖3。

圖3 乳腺癌MCF-7/Ful細胞中PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的檢測結果

3.4 Ori和Ful的體內抑瘤效應驗證結果

與空白對照組和Ful組比較，Ful+Ori組裸鼠的腫瘤生長速度明顯降低，腫瘤體積從12 d開始具有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01），各組裸鼠的腫瘤體積變化曲線見圖4。給藥結束后，與空白對照組和Ful組比較，Ful+Ori組裸鼠腫瘤質量著減小（P＜0.01）；Ful+Ori組的抑瘤率為（63.90±4.11）%，較Ful組顯著增加（P＜0.01），各組裸鼠腫瘤質量與抑瘤率見表2。

圖4 各組裸鼠的腫瘤體積變化曲線

表2 各組裸鼠腫瘤質量及抑瘤率結果比較（±s，n＝8）

表2 各組裸鼠腫瘤質量及抑瘤率結果比較（±s，n＝8）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與Ful組比較，P＜0.01；－：無數據

抑瘤率/%－13.40±3.32 17.00±2.36 63.90±4.11b組別空白對照組Ori組Ful組Ful+Ori組腫瘤質量/g 3.30±0.65 2.84±0.36 2.74±0.25 1.19±0.12ab

4 討論

現階段乳腺癌的治療以化療為主，但長期化療會造成人體損傷，引發毒副作用和耐藥。耐藥性的產生是乳腺癌患者臨床治療失敗的主要原因。Ful是近年來開發的一種抗雌激素藥物，因其可靠的臨床效果及獨特的作用機制，受到臨床好評，但Ful的耐藥性仍是急需解決的問題[15－17]。

Ori對腫瘤具有一定的預防和治療作用，能夠抑制肝癌、卵巢癌及胃癌等多種腫瘤細胞的增殖，在逆轉腫瘤耐藥方面有一定效果[18－20]。本研究通過Ful誘導乳腺癌MCF-7細胞獲得耐藥性MCF-7/Ful細胞，同時不同濃度的Ori可以對乳腺癌MCF-7/Ful細胞產生明顯的抑制作用，表明Ori能夠逆轉乳腺癌MCF-7細胞對Ful的耐藥。通過CompuSyn軟件分析發現，5 μmol/L的Ori和8 μmol/L的Ful聯合作用時，相關聯合指數最小，表明二者聯用對乳腺癌MCF-7/Ful細胞抑制效果最好，逆轉耐藥效果也最佳。

PI3K/Akt信號通路的異常活化在大多數腫瘤中都有發生。研究表明，PI3K/Akt信號通路在介導腫瘤多藥耐藥導致化療和放療抵抗方面發揮著重要作用[21]。本研究結果顯示，與Ful組比較，Ful+Ori組細胞中p-PI3K/PI3K比值、p-Akt/Akt比值顯著降低，表明Ful和Ori聯合使用后能夠有效抑制PI3K和Akt的磷酸化，發揮逆轉耐藥的作用。

裸鼠因胸腺缺失，缺乏成熟的T淋巴細胞，能夠使移植后的腫瘤細胞生長良好，并能保持腫瘤細胞原有的形態和病理特性，成為腫瘤研究中較為理想的動物實驗工具[22]。為進一步驗證Ori逆轉耐藥的體內效應，本研究采用乳腺癌MCF-7/Ful耐藥細胞構建了裸鼠移植瘤模型。實驗結果表明，Ori聯合Ful能夠明顯減緩腫瘤生長速度，降低腫瘤質量，提高抑瘤率。

綜上所述，Ori能夠逆轉乳腺癌MCF-7細胞對Ful的耐藥，此作用可能是通過調控PI3K/Akt信號通路實現的，逆轉耐藥效果在裸鼠體內也得到驗證，本研究可為乳腺癌的臨床治療提供實驗依據。