肺炎克雷伯菌對多黏菌素的耐藥機(jī)制研究進(jìn)展Δ

徐 特，錢 妍，李 頔（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400010）

肺炎克雷伯菌是腸桿菌科克雷伯菌屬中最主要的一種病原菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，同時(shí)其也可定植于人的腸道、口腔以及皮膚等部位。肺炎克雷伯菌作為院內(nèi)及社區(qū)感染的常見致病菌，可導(dǎo)致肺炎、尿路感染、膿毒血癥及肝膿腫等疾病。由于抗生素的大量使用，肺炎克雷伯菌呈現(xiàn)出多藥耐藥（multiple drug resistance，MDR）趨勢，尤其是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenemresistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）的出現(xiàn)，意味著可用于治療肺炎克雷伯菌感染的抗生素越來越少，嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。

多黏菌素是由多黏芽孢桿菌合成的一類具有抗菌活性的物質(zhì)，對肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌等有著良好的殺菌作用。由于多黏菌素具有神經(jīng)及腎臟毒性，所以該藥在臨床上已很少使用。鑒于CRKP嚴(yán)峻的耐藥現(xiàn)狀以及可使用的抗生素屈指可數(shù)，多黏菌素以其獨(dú)特的抗菌機(jī)制成為了治療CRKP感染的最后一道防線[2]。但隨著近數(shù)十年來多黏菌素使用的增加，國內(nèi)外肺炎克雷伯菌耐藥株的報(bào)道也呈上升趨勢[3]。這不僅大大增加了感染的防控成本，也危害著患者的生命安全。基于此，本文就目前已報(bào)道的肺炎克雷伯菌對多黏菌素的耐藥機(jī)制作一綜述，以期為多黏菌素的合理使用及耐藥肺炎克雷伯菌的防治提供依據(jù)。

1 多黏菌素的抗菌機(jī)制

多黏菌素是一類環(huán)狀肽抗菌劑，按結(jié)構(gòu)差異可將此類藥物分為A、B、C、D、E類。臨床上最常用的是多黏菌素B和多黏菌素E（也稱黏菌素）。這2種藥物均表現(xiàn)出親水、親脂的兩性分子特點(diǎn)，只是在肽環(huán)上的氨基酸不同——多黏菌素B為D-苯丙氨酸，多黏菌素E為D-亮氨酸（具體化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）。多黏菌素B、E對病原菌的作用機(jī)制類似，兩者化學(xué)結(jié)構(gòu)中所含的二氨基丁酸殘基可與革蘭氏陰性菌外膜脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）部件脂質(zhì)A上的游離磷酸基團(tuán)直接結(jié)合，從而破壞細(xì)菌外膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致菌體破裂、溶解，繼而發(fā)揮殺菌作用[4－6]。除上述作用機(jī)制外，目前還有很多關(guān)于多黏菌素殺菌機(jī)制的假說，包括影響細(xì)菌的結(jié)構(gòu)、呼吸作用、核糖體結(jié)合和分裂以及誘導(dǎo)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生等[7]。

圖1 多黏菌素B、E的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 多黏菌素的耐藥機(jī)制

由于多黏菌素的主要作用靶點(diǎn)是LPS，因此目前大多數(shù)多黏菌素耐藥機(jī)制研究主要集中在LPS的結(jié)構(gòu)修飾上[3]。此外，莢膜多糖過表達(dá)、外排泵過表達(dá)等機(jī)制也被證實(shí)與耐多黏菌素肺炎克雷伯菌的出現(xiàn)有關(guān)[8－9]。基于此，本文對這幾種耐藥機(jī)制進(jìn)行歸納介紹。

2.1 LPS的結(jié)構(gòu)修飾

2.1.1 染色體介導(dǎo)的LPS結(jié)構(gòu)修飾 肺炎克雷伯菌的LPS結(jié)構(gòu)修飾主要是向脂質(zhì)A添加4-氨基-L-阿拉伯糖（4-amino-4-deoxy-L-arabinose，L-Ara4N）或磷酸乙醇胺（phosphoethanolamine，pEtN），這2種修飾會導(dǎo)致LPS結(jié)構(gòu)和電位發(fā)生改變，從而減少多黏菌素與肺炎克雷伯菌的結(jié)合[10－11]。

上述2種LPS結(jié)構(gòu)修飾與PmrA/B以及PhoP/Q雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活密切相關(guān)。PmrA/B與PhoP/Q均為跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件，其中PhoQ和PmrB為組氨酸激酶，可感應(yīng)外界刺激，從而活化細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的反應(yīng)調(diào)控因子[12]。PhoQ、PmrA、PmrB基因的錯(cuò)義突變導(dǎo)致PmrA/B的活化，從而上調(diào)PmrCAB和arnBCADTEF（也稱為PmrHFIJKLM）操縱子，進(jìn)而促進(jìn)pEtN和L-Ara4N的合成以及向脂質(zhì)A的轉(zhuǎn)移。其中，pEtN可升高脂質(zhì)A的電位，L-Ara4N可直接中和脂質(zhì)A的電荷[13－15]。另外，PhoP/Q雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子MgrB基因的突變也被證實(shí)可導(dǎo)致細(xì)菌對多黏菌素耐藥，其原因一方面在于MgrB對PhoP/Q雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的抑制作用減弱，導(dǎo)致eptE（pEtN轉(zhuǎn)移酶）促使pEtN向外膜3-脫氧-D-甘露糖醛酸殘基轉(zhuǎn)移，另一方面MgrB的插入失活（如可移動元件ISKpn14序列）可活化PmrA調(diào)控因子，進(jìn)而促進(jìn)L-Ara4N的合成以及向脂質(zhì)A的轉(zhuǎn)移[16－17]。PmrD作為一類連接PmrA/B及PhoP/Q的信號蛋白，可以阻斷經(jīng)PmrB活化后的磷酸化PmrA的固有去磷酸化，從而促進(jìn)PmrA下游基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，最終加強(qiáng)LPS結(jié)構(gòu)修飾，導(dǎo)致耐藥[18]。

CrrA/B是一類新發(fā)現(xiàn)的可能與多黏菌素耐藥機(jī)制有關(guān)的雙組分系統(tǒng)，同樣由感受器和調(diào)控因子組成，其所介導(dǎo)的多黏菌素耐藥機(jī)制表現(xiàn)為調(diào)節(jié)CrrB基因臨近的H239-3059基因、H239-3062基因（即CrrC基因，與糖基轉(zhuǎn)移相關(guān)）來影響LPS修飾[19]。Cheng等[11]研究發(fā)現(xiàn)，CrrB的氨基酸替換會降低肺炎克雷伯菌對多黏菌素的敏感性，這是因?yàn)镃rrB基因的突變可誘導(dǎo)H239-3062（即CrrC）表達(dá)，而CrrC可通過PmrA/B促進(jìn)PmrC和PmrHFIJKLM操縱子的表達(dá)，進(jìn)而使細(xì)菌對多黏菌素耐藥。

綜上，肺炎克雷伯菌對多黏菌素耐藥的調(diào)控通路主要包括PhoP/Q、PmrA/B、CrrA/B這3類雙組分系統(tǒng)，且三者之間存在密切聯(lián)系（三者參與LPS結(jié)構(gòu)修飾的機(jī)制見圖2）。

圖2 雙組分系統(tǒng)參與LPS修飾的機(jī)制

2.1.2 質(zhì)粒介導(dǎo)的LPS修飾 除上述集中由染色體介導(dǎo)的耐藥調(diào)控基因突變外，革蘭氏陰性菌還可通過質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素可移動耐藥（mobile colistin resistance，mcr）基因及其變異體在菌群間的水平傳播而獲得耐藥[20]。在Du等[21]第一次發(fā)現(xiàn)攜帶mcr-1基因的耐多黏菌素肺炎克雷伯菌后，在中國[22]、意大利[23]、埃及[24]等地已有多篇有關(guān)mcr基因及其變異體導(dǎo)致細(xì)菌對多黏菌素耐藥的報(bào)道，且來源包括了人、動物以及環(huán)境樣本等。mcr基因的獨(dú)特遺傳結(jié)構(gòu)在很大程度上造成了該基因的全球擴(kuò)散。

mcr基因多位于質(zhì)粒（包括IncI2、IncHI2、IncX4、IncN等）上，且基因結(jié)構(gòu)中多包含有移動元件ISApl1。mcr基因具有可傳播性，含有與以上幾類質(zhì)粒遺傳結(jié)構(gòu)類似的細(xì)菌更易于通過質(zhì)粒結(jié)合獲得耐藥性，這也導(dǎo)致了耐藥菌株的快速擴(kuò)散[25]。除mcr-1外，在肺炎克雷伯菌中也發(fā)現(xiàn)了mcr-1的等位基因，如mcr-2、mcr-3、mcr-7、mcr-8、mcr-9等[24，26－28]。以mcr-1為例，其編碼的pEtN轉(zhuǎn)移酶可催化已合成的pEtN向脂質(zhì)A磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移，增加脂質(zhì)A位點(diǎn)的陽離子電荷，從而減少多黏菌素與LPS的結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌對多黏菌素耐藥[5]。

2.2 莢膜多糖的過表達(dá)

Campos等[29]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肺炎克雷伯菌暴露于多黏菌素時(shí)，莢膜多糖的過表達(dá)可對肺炎克雷伯菌起保護(hù)作用。莢膜多糖存在于細(xì)菌的最外層，作為物理屏障其可減輕菌體受到的外界傷害。莢膜多糖可通過與多黏菌素結(jié)合來減少多黏菌素與LPS的作用。另外，該學(xué)者團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，部分肺炎克雷伯菌缺乏含O抗原的LPS，其莢膜多糖是唯一可阻礙多黏菌素作用的屏障。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌可從菌體表面釋放帶負(fù)電荷的莢膜多糖，這類莢膜多糖可捕獲多黏菌素，使多黏菌素與非活性位點(diǎn)的作用增加，進(jìn)而減少多黏菌素與細(xì)胞外膜的接觸，從而影響其正常殺菌作用[30]。Fresno等[8]提出，莢膜多糖是以離子相互作用的形式穩(wěn)定結(jié)合于LPS，當(dāng)環(huán)境中存在多黏菌素時(shí)，該離子相互作用會被多黏菌素所帶的電荷擾亂，故莢膜多糖可脫離LPS與多黏菌素結(jié)合，進(jìn)而減輕多黏菌素對肺炎克雷伯菌外膜的破壞。另一項(xiàng)關(guān)于抗菌肽對肺炎克雷伯菌外膜作用的研究發(fā)現(xiàn)，外膜蛋白OmpA缺失的菌株，其莢膜多糖表達(dá)下降，進(jìn)而導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對多黏菌素B的敏感性增加[31]。由此可知，可通過抑制OmpA來緩解耐藥，這為克服細(xì)菌耐藥性提供了新思路。

2.3 外排泵的過表達(dá)

細(xì)菌多藥外排泵被認(rèn)為與耐藥密切相關(guān)。Srinivasan等[32]研究發(fā)現(xiàn)，KpnEF外排泵可介導(dǎo)肺炎克雷伯菌對多黏菌素耐藥，該外排泵屬于小多藥外排家族（small MDR family，SMR），另外KpnEF跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白失活還可導(dǎo)致莢膜多糖的合成障礙。全基因組測序發(fā)現(xiàn)，存在KpnEF基因點(diǎn)突變且同時(shí)合并PmrA、CrrB基因突變的肺炎克雷伯菌可對多黏菌素表現(xiàn)出耐藥[33]。Padilla等[34]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)編碼acrAB多藥外排泵的基因被敲除后，肺炎克雷伯菌對多黏菌素的敏感性相較于野生型菌株發(fā)生改變。該外排泵由acrRAB操縱子編碼，其中acrA編碼錨定于細(xì)胞內(nèi)膜上連接內(nèi)膜與外膜的間質(zhì)蛋白，acrB編碼錨定于細(xì)胞質(zhì)膜的整合蛋白，acrR編碼外排泵的抑制因子。相較于野生型菌株，acrB基因敲除菌株對多黏菌素更為敏感，而acrR敲除的菌株則相反，這說明acrR對藥物外排表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。另有研究發(fā)現(xiàn)，CrrB基因的點(diǎn)突變可導(dǎo)致屬于耐藥結(jié)節(jié)分化（resistance nodulation division，RND）家族的新型外排泵H239-3064的表達(dá)減少，當(dāng)該外排泵過表達(dá)時(shí)，肺炎克雷伯菌對多黏菌素的敏感性大大降低[35]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，多藥外排泵KeXD與H239-3064有著100%的氨基酸一致性，提示KeXD也可因CrrB的突變而出現(xiàn)過表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)菌對多黏菌素耐藥[36]。RamA和SoxS是AcrBTolC外排泵的調(diào)節(jié)因子，相較于多黏菌素敏感株，兩者在耐藥株中的表達(dá)更高，其中RamA同時(shí)影響著脂質(zhì)A的合成，在其負(fù)調(diào)節(jié)因子RamR失活的情況下，脂質(zhì)A的合成增加，因而使細(xì)菌表現(xiàn)出對多黏菌素不敏感[37－38]。

3 異質(zhì)性耐藥

由單一分離菌株培養(yǎng)所得的細(xì)菌群體中，可能存在不同亞群耐藥情況不同的現(xiàn)象，如部分敏感、部分耐藥，此種情況為異質(zhì)性耐藥，即有著相同或相似基因型的菌株卻表現(xiàn)出不同的耐藥表型。一旦暴露于抗生素中，異質(zhì)性耐藥菌株即可被篩選出來[39]。目前，臨床常以最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）來判斷細(xì)菌是否耐藥，但在某些敏感菌株中，僅以MIC判斷則難以排除異質(zhì)性耐藥。雖然，導(dǎo)致異質(zhì)性耐藥發(fā)生的機(jī)制尚不明確，但已有報(bào)道證明，亞群耐藥性的出現(xiàn)與增強(qiáng)主要是由包括典型抗性基因在內(nèi)的基因自發(fā)性擴(kuò)增所致[40]。多黏菌素異質(zhì)性耐藥的出現(xiàn)，很有可能部分與多黏菌素耐藥調(diào)控相關(guān)基因發(fā)生不穩(wěn)定突變有關(guān)。Jayol等[41]和Halaby等[42]的研究均發(fā)現(xiàn)，多黏菌素異質(zhì)性耐藥的肺炎克雷伯菌的PhoQ基因存在突變，且后者還發(fā)現(xiàn)mgrB、yciM基因（編碼LPS調(diào)節(jié)蛋白）和lpxM基因亦存在突變，這提示除LPS結(jié)構(gòu)修飾外，多黏菌素耐藥可能還存在其他機(jī)制[43]。Cheong等[44]在一株分離自住院患者的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了mutS的無義突變，該突變直接導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對阿米卡星的耐藥以及對多黏菌素的異質(zhì)性耐藥，且該基因編碼一種廣泛存在于肺炎克雷伯菌中的DNA修復(fù)酶，這意味此耐藥突變很有可能影響肺炎克雷伯菌在臨床上的防治過程。

4 結(jié)語

多黏菌素作為目前用于治療多藥耐藥革蘭氏陰性菌感染的“最后防線”，由于其使用增加以及耐藥基因的水平傳播等，導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對其耐藥增加。綜上所述，肺炎克雷伯菌耐多黏菌素的機(jī)制包括細(xì)菌外膜LPS的結(jié)構(gòu)修飾（主要為L-Ara4N和pEtN向脂質(zhì)A轉(zhuǎn)移）、莢膜多糖的過表達(dá)、多藥外排泵的過表達(dá)等。就LPS結(jié)構(gòu)修飾而言，染色體介導(dǎo)的LPS結(jié)構(gòu)修飾直接導(dǎo)致了細(xì)菌的獲得性耐藥，質(zhì)粒介導(dǎo)的LPS結(jié)構(gòu)修飾則引發(fā)了耐藥性的水平傳播。雖然肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制可分為上述幾種，但在不同的肺炎克雷伯菌菌株中，可能存在多種耐藥機(jī)制共存的現(xiàn)象，而且肺炎克雷伯菌作為院內(nèi)感染的主要病原菌，常與其他致病菌共同檢出，這也有可能導(dǎo)致產(chǎn)生某些本不屬于肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制。現(xiàn)有研究可能還無法解釋某些臨床中存在的問題，如異質(zhì)性耐藥的具體機(jī)制等，但相信未來的科學(xué)研究將進(jìn)一步明確肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制，為耐藥菌的檢測以及感染的防控提供證據(jù)支撐。雖然目前對已發(fā)生的多黏菌素耐藥尚無較好的阻斷實(shí)踐，但為避免多黏菌素耐藥現(xiàn)狀的進(jìn)一步惡化，應(yīng)合理優(yōu)化臨床用藥，加強(qiáng)監(jiān)督管理，盡可能減少耐藥基因的擴(kuò)散。