不同月季品種灰霉病抗性鑒定及與表型相關性分析

李思思，韓洋琳，袁文斌，楊佳，李學，吳紅芝*

（1云南農業大學園林園藝學院，云南昆明650201；2云南農業大學動物科學技術學院，云南昆明650201）

0 引言

【研究意義】月季（spp.）是薔薇科薔薇屬（）植物的統稱，既是世界四大鮮切花之一，也是我國十大名花之一，我國有52個城市將其選為市花，享有“花中皇后”的美譽（Debener and Byrne，2014）。月季切花居世界四大切花之首，占全球切花產業總量的三分之一以上（Cao et al.，2019），在切花市場具有重要地位。切花作為月季的主要產品形式，其采后品質直接決定了月季的觀賞和經濟價值。然而，隨著種植規模的迅速擴大，月季灰霉病（Grey mould）危害嚴重，已成為月季采后最嚴重的病害，顯著降低月季的觀賞價值，被稱為月季切花采后的“癌癥”（張雙艷等，2019）。化學殺菌劑對預防月季灰霉病發展的效果有限，也不能有效控制潛伏感染，并且病原菌易對殺菌劑產生抗藥性，單純的化學防治方法很難達到良好的防治效果（陳樂等，2020）。由于現代規模化種植中品種退化、病蟲危害嚴重等問題，月季育種目標也由原來追求品種外在特征如花色、花型、花香、株型等擴大到其內在品質如抗病蟲害、抗旱、抗寒、耐熱性的提高等（張杰，2014）。因此，對月季資源進行灰霉病抗性評價，發掘優異抗病種質，對月季灰霉病的抗病育種及科學防控具有重要意義。【前人研究進展】灰霉病是由葡萄孢屬真菌（spp.）引起的死體營養型真菌病害（張中義和張陶，2006），該病原菌在侵染植物時其分生孢子、分生孢子梗和菌絲可作為侵染源，侵染后期在被侵染部位形成灰色霉層，因而得名（Williamson et al.，2007）。據報道，灰霉病菌已成為繼稻瘟病菌之后的第二大植物病原真菌（Hao et al.，2017），在已報道的葡萄孢屬真菌中灰葡萄孢菌（）分布最廣、研究最多、寄主范圍最廣，也是引起月季灰霉病的最主要病原菌（肖景惠等，2019）。灰葡萄孢菌感染和攻擊寄主細胞的能力非常強大，孢子可隨風、水、農事操作等進行傳播，同時易對殺菌劑產生抗藥性，在感染過程中寄主植物表面的灰葡萄孢菌分生孢子萌發長出芽管并分化發育成菌絲，誘發細胞壁降解酶、植物毒素、草酸等致病因子，使孢子進入寄主組織中，孢子在穿透寄主表皮時會產生次生代謝產物和誘導宿主細胞死亡的植物毒性蛋白，導致花瓣壞死，并在壞死花瓣表面產生大量的無性分生孢子進行再次侵染，循環往復，造成大面積感染（van Kan，2005；Hao et al.，2017；孔瓊等，2020）。被侵染后的月季花瓣開始產生斑點或火燎狀斑塊，花瓣邊緣變為褐色逐漸腐爛直至產生灰色霉層，嚴重影響切花品質（韓洋琳等，2021）。抗病品種的培育和推廣是防治灰霉病的重要措施之一。目前國內外對月季灰霉病的相關研究主要集中在抗病分子機制揭示及抗病基因篩選方面。Liu等（2018）通過月季灰霉病菌接種花瓣進行RNA-Seq分析，揭示了油菜素內酯在月季防御灰葡萄孢侵染中的作用；Liu等（2019）對中國古老月季WRKY基因進行全基因組分析，確定為應對灰葡萄球菌感染的候選調控基因，并通過VIGS技術驗證了該基因的功能；Ren等（2020）利用VIGS技術沉默和基因，提高了月季植株對灰霉病菌的敏感性，證實和基因在植株應答灰霉病菌脅迫中發揮著重要作用。近年來國內月季育種研究工作進展迅速，大量新品種被選育出來，同時還有大量優秀國外品種被引入到國內種植，但有關抗性種質資源篩選的研究相對較少（陳宇春等，2020）。Cao等（2019）通過優化花瓣圓片接種法鑒定月季灰霉病相關抗性基因時使用19個月季栽培品種進行灰霉病敏感性研究，發現不同品種對灰霉病的敏感性存在較大差異，但該研究涉及的月季品種較少，其研究也不是針對月季灰霉病抗性鑒定。【本研究切入點】前人關于月季的研究主要集中在育種技術、植株類型和觀賞品質等方面，隨著現代設施栽培的發展和月季采后貯運量的增大，月季灰霉病的發生和造成的損失更加嚴重，月季灰霉病抗性育種也越來越受到人們的關注。目前，有關月季灰霉病抗性的研究少有報道，尤其缺乏對現有優良栽培品種灰霉病抗性的系統評價。【擬解決的關鍵問題】采用離體花瓣接種灰霉病菌法結合2019和2020連續2年田間自然發病情況調查，對349個月季主栽培品種進行灰霉病抗性評價，篩選抗病品種；調查349個月季品種的花色、花香、莖皮刺量、花徑和花瓣數等表型性狀，進行表型性狀與灰霉病抗性的相關性分析；選擇抗病性評價結果為高抗、抗病和中抗的月季品種進行聚類分析，明確抗病性與表型性狀的相關關系，挖掘抗病且觀賞價值高的品種（系），為月季抗病育種及生產提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 月季品種供試材料為種植于云南嵩明月季DUS資源圃中的349個月季主栽品種，參考薛麒麟和郭繼紅（2004）的分類系統，將349個月季品種分為藤本月季（Climbers，CL）、豐花月季（Floribundas，F）、雜交茶香月季（Hybrid Tea，HT）、微型月季（Miniature，Min）、地被月季（Grand Cover Roses，R）和灌木月季（Shrubs，SH），田間調查前1個月停止使用殺菌劑。

1.1.2 灰霉病菌菌株接種菌株KMSC-011為云南農業大學園林園藝學院園林育種實驗室分離純化，通過鑒定為灰葡萄孢菌。

1.2 試驗方法

1.2.1 月季灰霉病田間抗性調查2019和2020年連續2年對資源圃內349個月季品種的灰霉病自然發病情況及抗性進行調查，資源圃中每個品種10株，大壟雙行栽植。根據每個品種花朵發病特征、病斑數量和大小進行病害分級。田間病害分級標準：0級，免疫，所有植株整株干凈，花、莖、葉均無病斑；1級，高抗（HR），輕微感病，整朵花花瓣上出現的病斑數少于5個，且呈分散狀；3級，抗病（R），花瓣上出現病斑數量少于10個，斑點面積小，且呈分散狀，葉片及其他花器上無病斑；5級，中抗（MR），花瓣上斑點數較少，斑點無連片現象，葉片及其他花器上無病斑；7級，感病（S），花瓣上有大量斑點，或出現水漬狀病斑；9級，高感（HS），水漬狀病斑腐爛，且有灰色霉層。

1.2.2 月季灰霉病抗性離體接種鑒定

1.2.2 .1灰葡萄孢菌孢子懸浮液制備將保存的菌株KMSC-011菌餅在超凈工作臺中用接種針挑至新的PDA培養基上，置于24℃避光條件下活化3～5 d，然后從菌落邊緣截取菌絲塊接種于新的PDA培養基上，置于24℃條件下避光培養10～15 d，直至培養基上長出灰色的分生孢子，在平板上倒入5 mL 20% PDB液體培養基，用滅菌接種環刮取培養基表面的孢子及菌絲，通過雙層紗布過濾掉菌絲和培養基雜質。用血球計數板測量分生孢子懸浮液濃度，使用20% PDB液體培養基將孢子懸浮液濃度稀釋至1×10個分生孢子/mL備用。

1.2.2 .2離體花瓣接種灰葡萄孢菌與抗性評價采用離體花瓣接種法對供試材料的灰霉病抗性水平進行鑒定。在月季資源圃中挑選干凈、無病蟲害并開花至第二階段的花枝（黃帥，2018），每個品種剪3～5支花，做好標記，帶回實驗室后立即插入水中備用。在接種盤內倒入無菌水，上面覆蓋一層吸水紙，水不能沒過紙面；取月季完整花瓣放在吸水紙上，在每個花瓣中央接種5μL的灰葡萄孢菌孢子懸浮液，蓋上托盤蓋，72 h后觀察發病情況，測量病斑面積，根據病斑面積進行病情分級，而后根據公式轉換為病情指數（DI）劃分抗病等級。

病情分級參考任志華（2019）、韓洋琳等（2021）的方法并根據接種后發病情況略作修改。病情分級標準：0級，花瓣無癥狀；1級，0＜病斑面積（mm）≤50；3級，50＜病斑面積（mm）≤150；5級，150＜病斑面積（mm）≤300；7級，300＜病斑面積（mm）≤600；9級，600＜病斑面積（mm）。抗病等級劃分標準：0級，DI=0，免疫；1級，0＜DI≤20，高抗（HR）；3級，20＜DI≤40，抗病（R）；5級，40＜DI≤60，中抗（MR）；7級，60＜DI≤80，感病（S）；9級，80＜DI≤100，高感（HS）。

1.2.3 表型性狀調查方法月季5個表型性狀調查參考王莉飛等（2021）的方法，均在盛花期進行調查，包括花色（Flower color，FC）、花徑（Flower diamter，FD）、花瓣數（Number of petals，PN）、莖皮刺量（Number of prickle thorns，PTN）、花香（Fragrance of flower，FF）。花色參照薛麒麟和郭繼紅（2004）的分類方法，分為9大色系，混合色、絞色和變色統一為復色系，使用英國皇家園藝學會比色卡（RHSCC）進行測定；花徑使用游標卡尺和直尺進行測量；花瓣數和莖皮刺量使用計數器進行統計。花瓣數統計（賈元義，2015）：單瓣，花瓣數（枚）≤6；半單瓣，6＜花瓣數（枚）≤15；適度豐滿，15＜花瓣數（枚）≤25；豐滿，25＜花瓣數（枚）≤35；非常豐滿，35＜花瓣數。莖皮刺量統計：無皮刺，花莖上無皮刺；皮刺少，主干及花莖上皮刺分布稀疏，皮刺數量少，花托下方無皮刺分布；皮刺較多，主干及花莖上皮刺分布較密，花托下方小刺量少；皮刺密，花莖上分布大小不一的皮刺，數量多且密。花香由同一人在每天上午對比記錄，將原始測量數據進行性狀編碼（表1）。

1.3 統計分析

使用Excel 2010進行數據整理，運用SPSS 19.0進行相關分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同月季資源對灰霉病的抗性評價

2.1.1 不同月季資源的田間抗性評價2019和2020年連續2年對田間種植的349個月季品種進行田間自然發病調查，綜合2次調查結果，發現供試品種對月季灰霉病的抗性表現較分散，月季灰霉病的發生與種植管理水平、季節及大棚內環境濕度密切相關，不同基地、不同品種、不同季節的田間灰霉病發生差異較大，發病株率在0～100%，大部分品種易感灰霉病。月季灰霉病主要發生在花瓣、花托和莖稈上，以花瓣上發生最為普遍，染病初期花瓣上產生小斑點，病斑顏色因品種不同而異，紅色和粉色品種一般表現為白色斑點，白色和黃色品種一般表現為紅色斑點，而后斑點擴大連片，出現火燎狀小斑或花瓣邊緣變褐色或卷曲，之后病斑迅速擴展連片成水漬狀，花瓣逐漸腐爛萎蔫，產生灰色霉層，若棚內濕度大，被孢子侵染的花瓣會快速發展為水漬狀并腐爛，產生霉層（圖1）。

如表2所示，供試月季2019和2020年總體的抗病趨勢基本一致，感病材料占大多數。2019年抗病材料有126個，占供試材料的36.10%，其中17個表現為高抗，占4.87%；40個為抗病，占11.46%；69個為中抗，占19.77%；其余的223個均為感病材料，占63.90%，其中感病材料最多，有116個，占33.24%。2020年高抗材料15個，較2019年有所下降，占4.30%；42個為抗病，占12.03%；68個為中抗，占19.48%；其余的224個均為感病材料，占64.19%，其中感病材料最多，有113份，占32.38%。結合2年的調查結果，有8個月季品種2年均表現為高抗，有少數材料2年間的抗性存在差異，如芳純和紅牡丹/亞克力紅2019年表現為高抗，2020年表現為抗病；和平和閃耀2019年表現為中抗，2020年則表現為感病，可能是由于當年的栽培技術、田間管控、溫度、濕度及其他病蟲害等因素的影響而造成的差異。

2.1.2 離體花瓣人工接種抗性評價 采用離體花瓣接種法對349個月季品種進行人工接種試驗，72 h后，供試材料都不同程度地感染了灰霉病菌，病斑為近似橢圓形的黃褐色水漬狀，病斑邊界清晰，本次試驗未發現免疫材料，不同抗病等級間病斑面積差異較大（圖2），如朱紅女王在72 h后病斑很小，只在接種液滴處稍擴散，平均病斑面積為6.02 mm（圖2-A），而黃金奧斯曼在接種72 h后病斑面積占整個花瓣面積一半以上，平均病斑面積為1006.37 mm，且發病部位腐爛（圖2-F）。

對349個月季品種的灰霉病抗性進行評價，結果（表2）顯示，349個月季品種中有高抗材料11個，占3.15%；抗病材料32個，占9.17%；中抗材料64個，占18.34%；感病材料114個，占32.66 %；高感材料128個，占36.68 %。有162個月季品種的人工接種抗性評價結果與田間抗性調查結果存在差異，其中有148個品種的人工接種抗性評價結果與田間調查結果相比僅存在一個抗病等級的差異，因此一致性差異不大；有187個品種抗性評價結果一致，占53.58%，其中朱紅女王、黑巴克、金色星光、桔魅（朱紅女王）、費加羅夫人、帕蒂坦、愛和輝煌8個品種的人工接種結果與田間調查結果均為高抗，其病斑平均面積為22.9 mm，病情指數（DI）均在15.6以下，說明田間調查抗病性的方法可作為人工接種的輔助方法驗證其抗病性，基于此結果篩選出的高抗種質可信度更高。

2.2 月季灰霉病抗性與表型性狀的相關分析結果

對349個月季品種的病情指數與表型性狀進行相關分析，結果（表3）顯示，月季資源的灰霉病病情指數與花色、花徑、花瓣數、花香不存在顯著相關關系（＞0.05，下同），與莖皮刺量呈顯著負相關（＜0.05），說明病情指數小的品種其莖皮刺量相對較多，抗灰霉病的月季材料莖皮刺量也相對較多。

2.3 抗灰霉病的月季資源表型性狀評價

采用歐式聚類分析方法對評價為高抗、抗病和中抗灰霉病的107個月季品種的花色、花徑、花瓣數、莖皮刺量和花香5個性狀數據進行聚類分析，結果（圖3）顯示，在歐式距離為5時將107個月季品種分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ等4組。第Ⅰ類31個月季品種，主要為大花香水月季，花瓣直徑大，花色以粉色、紅色、暗紅色、紫色和復合色為主，花香較淡，多為輕香型，花瓣數較多，瓣型豐滿；第Ⅱ類包括24個月季品種，主要為大花香水月季和豐花月季，花瓣直徑較大，花色主要為白色、綠色、黃色及橙色，花瓣數多，較豐滿；第Ⅲ類包括16個月季品種，主要為微型月季和藤本月季，花瓣直徑較小，花色主要為粉色、紅色、暗紅色和紫色，花香主要為輕香型和無香型；第Ⅳ類包括36個月季品種，主要為大花香水月季、豐花月季和微型月季，花色主要為黃色、橙色、粉色和紅色，花朵直徑較第Ⅲ類大、較第Ⅰ和Ⅱ類小，花香主要為輕香和無香型。

3 討論

3.1 月季資源抗性評價

對于病害防治，選育和使用抗病品種（系）是最經濟有效的措施，而抗性材料的篩選是品種改良、種質創新及抗病育種的重要基礎（陳麗等，2020；范德佳等，2020），但目前關于月季資源的抗性鑒定、抗病種質篩選、抗病指標及抗病機理等方面的研究大多集中在白粉病、黑斑病等病害，對月季灰霉病的研究相對較少（陳宇春等，2020）。不同月季資源對灰霉病具有不用的抗性水平，不同鑒定方法及植物材料種植的地理位置差異也會使鑒定結果存在分歧。本研究通過離體花瓣接種鑒定，結合2019和2020年田間抗病性調查，綜合3次評價結果發現朱紅女王、黑巴克、金色星光、桔魅（朱紅女王）、費加羅夫人、帕蒂坦、愛和輝煌8個品種均表現高抗，未發現有免疫月季灰霉病的資源。莊得鳳等（2017）對來自國內外不同地區、不同類型的349份月季資源進行了田間白粉病抗性評價，篩選出愛、春和芭比等13個高抗品種，結合本研究結果，發現月季品種愛對白粉病和灰霉病均表現為高抗，可作為抗病育種優異備選材料。

3.2 不同月季灰霉病抗性鑒定方法的差異分析

植物種質資源的抗病性鑒定通常是使用人工接種病原菌或田間自然發病情況下抗病性調查的方法進行（劉杰，2019）。本研究采用離體花瓣接種法結合田間自然發病情況調查對供試的349個月季品種資源的灰霉病抗性進行評價，發現田間調查結果與人工接種結果一致的有187個品種，大部分品種的評價差異不大，但也有Cabaret和索力多等少數幾個品種的抗病評價存在較大差異，主要表現為田間調查發病情況較離體接種的嚴重。可能是田間灰霉病抗病性調查的品種是種植在DUS測試中心的溫室內，溫室中不同位置的溫度、濕度、通風等因素不同均可能影響植株的病害發生，尤其是灰霉病的發生顯著受溫度、濕度等環境因子影響（馬丹等，2009）；在溫室大棚中，月季白粉病與灰霉病時常伴隨發生，一般情況下月季感染白粉病后極易感染灰霉病（Williamson et al.，2007）。此外，田間灰霉菌株類型復雜，灰霉病菌種內變異豐富，有些菌株可能產生克服寄主的抗性，這些因素都有可能是田間評價與人工接種結果存在差異的原因。

侯琿等（2017）利用田間自然發病抗性鑒定法與人工接種枝條鑒定法相結合，對189份栽培種蘋果種質資源進行蘋果輪紋病綜合抗性鑒定，發現2種方法鑒定出的結果也存在一定差異，但發現綜合2種結果篩選出的高抗蘋果資源更具有利用價值。蔣時姣（2019）利用田間調查及人工接種的方法對18個核桃不同品種（無性系）的黑斑病抗性進行評價，發現植株葉片接種評價可作為田間調查評價的補充，為核桃黑斑病抗性材料的篩選提供依據。田間自然發病情況下存在許多不確定因素，可在沒有人為影響的條件下篩選出高抗資源，篩選出的資源可能對其他病害也具有一定抗性，其結果通過接種鑒定進一步驗證保證了可靠性；人工接種鑒定可保證接種條件的一致性，且用時短，能更快、更準確地評價月季的抗病性。說明田間抗性調查結合人工接種對抗性評價結果更準確，可靠性更高，更具有利用價值。

3.3 月季資源灰霉病抗性與表型性狀的相關性

作物表型性狀具有直觀、易于識別的特點，是作物種質資源研究和遺傳分類的重要依據，通過對表型性狀的鑒定和評價，可為作物優異基因資源發掘和利用提供重要信息（吳芳芳等，2020；張鴻燕等，2020）。本研究通過對月季表型性狀觀察，結果表明349個月季品種資源的花瓣大小及顏色等均呈現出多樣性。對月季灰霉病的病情指數與花色、花徑、花瓣數、莖皮刺量和花香進行相關性分析，發現月季資源的灰霉病病情指數與花色、花徑、花瓣數和花香不存在顯著相關，與其莖皮刺量呈顯著負相關，說明莖皮刺量的多少可能與月季灰霉病抗性有關，如紅絲絨、蘭奇跡和卷邊多頭粉等品種枝刺較密，對灰霉病表現為抗病。皮刺是植物表皮或皮層形成中尖銳突起的腺毛狀體，被認為是植物為適應環境而形成的一種特殊防衛組織，保護植物免受動物、病原體或機械傷害（Kellogg et al.，2011）。兩面針、刺天茄和蕁麻等植物的葉面刺被認為是植物對生物脅迫的防御機制，可有效抵御病原菌、昆蟲和動物的傷害，具有保護植株的功能（武延生等，2021），而月季皮刺是否與植物抵御生物脅迫的機制有關，還有待進一步驗證。

3.4 抗灰霉病月季種質資源表型性狀評價

植物的表型性狀與抗性和經濟性狀等相關，是評價植物抗性和生產性能的重要因素，也是生產和試驗關注的主要性狀（王焱，2018）。月季種質資源除具有良好的抗病性外，還應具有優異的觀賞性狀。李東麗等（2019）通過對306份月季材料聚類分析發現同組中花型和花色表現出高度一致性，對雜交組合以及親本的分析發現相同花型的資源之間親緣關系更近。本研究中，基于花色、花徑等5個表型性狀的聚類分析將107個抗病品種分為4大類群，通過對聚為一類的月季資源進行分析，發現月季主要品種的類別、花朵大小可能與來源存在一定關聯性，部分類型一致、花朵大小相近的月季材料首先聚為一類，如第Ⅰ和第Ⅱ類群主要為大花香水月季和豐花月季，通過對其雜交組合及親本的分析，發現大花香水月季和豐花月季由法國薔薇（）、月季花（）和突厥薔薇（）的雜交后代選育而來，親緣關系更近。這2個類群的月季資源具有抗灰霉病、花朵直徑大、瓣型豐滿等優良特性，育種應用潛力更大。

4 結論

明確了349個月季主要栽培品種在田間和人工接種條件下的灰霉病抗感情況，篩選出朱紅女王、黑巴克、金色星光、桔魅（朱紅女王）、費加羅夫人、帕蒂坦、愛和輝煌8個高抗品種；月季灰霉病抗性與莖皮刺量可能存在關聯性；聚類分析結果表明聚在第Ⅰ和第Ⅱ類群的月季品種具有高抗病性和花大、瓣型豐滿等優良性狀，具有較高的利用潛力。