單一和復合乳酸菌添加對高丹草青貯效果的影響

付薇，陳偉，王小利，周麗，覃濤英，韓永芬*，孟軍江

（1貴州省草業研究所，貴州貴陽 550006；2貴州金農富平生態農牧科技有限公司，貴州銅仁 554100）

0 引言

【研究意義】高丹草（×）是由飼用高粱［（L.）Moench］和蘇丹草［（Piper）.Stapf］雜交產生的禾本科高光效C4植物，其鮮草產量高，再生能力強、抗倒伏、粗蛋白質含量高，飼喂家畜消化率高、適口性好（白春生等，2020）。6—9月是高丹草的生長旺季，集中生長通常造成鮮草過剩，利用乳酸菌發酵迅速降低體系pH，最大程度減緩植物呼吸，抑制好氧微生物生長，是目前長效保存高丹草的常用辦法。【前人研究進展】國內學者從營養供給、留茬高度、混合青貯等方面對高丹草發酵效果開展了一定研究。白春生等（2020）通過不同施氮量和留茬高度開展高丹草發酵品質比較研究，結果表明施氮量300 kg/ha時，高丹草青貯發酵品質良好，留茬高度從15 cm增至60 cm，可明顯改善高丹草青貯飼料的營養價值；張歡等（2020）、郭暉（2021）開展高丹草與紫花苜蓿混貯比例研究，結果表明混合高丹草能顯著降低青貯pH，各混貯比例間發酵品質差異顯著；尤思涵等（2021）研究高丹草與黑麥草混貯效果，結果表明高丹草與黑麥草以3∶7比例混貯，可獲得最高乳酸值和乳酸菌數量。有研究發現，添加適宜乳酸菌可快速主導發酵，有效增加環境乳酸含量、加速青貯進程，對改善底物營養品質有著積極的促進作用（許冬梅等，2017；周俊華等，2020）；但不同類型乳酸菌具有不同的發酵功能，底物種類、乳酸菌類別、菌系間協同作用等多種因素均會對青貯的終期發酵效果產生不同程度的影響（Liu et al.，2016；Oliveira et al.，2017）。植物乳桿菌（）和戊糖片球菌（）是青貯常見的同型發酵乳酸菌，在快速增加乳酸含量、降低pH和減緩營養損失方面效果顯著（關皓等，2017）；李小鈴等（2019）利用植物乳桿菌、戊糖片球菌和食竇魏斯氏菌（）復合添加發酵扁穗牛鞭草，其微生物菌群和感官品質最優，乳酸含量最高。短乳桿菌（）為異型發酵乳酸菌，青貯時能產生大量抑制酵母菌、霉菌等好氧微生物生長的乙酸（黃峰等，2019）。徐生陽等（2019）研究指出，短乳桿菌對防止全株玉米青貯有氧腐敗變質有顯著作用。【本研究切入點】不同乳酸菌復合添加對不同作物青貯效果的影響有所差異（苗芳等，2017；王旭哲等，2018），但其對高丹草青貯品質及微生物變化的影響研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】以前期從禾本科牧草中篩選出的植物乳桿菌、戊糖片球菌和短乳桿菌為試驗材料，通過單一和復合乳酸菌添加，探索不同菌劑組配對高丹草青貯效果的影響，為高丹草優良青貯菌劑的研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青貯原料為蜀草1號高丹草，于2018年4月12日播種于貴州省草業研究所松桃縣高產飼草基地，種植面積0.67 ha，種植行距50 m×50 m，2018年7月31日蠟熟初期收割。供試菌種是貴州省草業研究所前期從禾本科牧草中分離獲得的植物乳桿菌（保存編號LP06）、戊糖片球菌（保存編號PP02）和短乳桿菌（保存編號LBR02）。

1.2 試驗方法

將高丹草晾曬至水分含量約65%，切碎至3～5 cm長度，裝入聚乙烯袋（塑料袋規格為600 mm×500 mm），每袋1500 g。設8個菌劑添加處理：（1）CK（無乳 酸 菌）；（2）LP06；（3）PP02；（4）LBR02；（5）F-1（LP06∶PP02=1∶1）；（6）F-2（LP06∶LBR02=1∶1）；（7）F-3（PP02∶LBR02=1∶1）；（8）F-4（LP06∶PP02∶LBR02=1∶1∶1），每處理3次重復，乳酸菌添加量5×10CFU/g。按10 mL/kg的總劑量混合各乳酸菌組合，10倍無菌蒸餾水稀釋后均勻噴灑至高丹草原料上，真空密封機抽氣密封，常溫貯藏60 d。

1.3 測定指標及方法

青貯60 d后開窖，對各處理進行感官品質評定，測定微生物數量、發酵品質和營養成分。

1.3.1 感官品質評定采用德國農業協會（Deutche Landwirtschaftes Gesellschaft，DLG）評分方法，根據氣味、結構和色澤3項指標對各處理青貯品質感官進行評定，總分20分，其中氣味14分，結構4分，色澤2分，得分16～20分為優等，10～15分為良等，5～9分為中等，0～4分為下等。

1.3.2 微生物數量測定包括乳酸菌、酵母菌和霉菌，稱取20 g樣品于180 mL無菌生理鹽水（0.85%NaCl）中，4℃下振蕩1 h后制備系列梯度稀釋液（10～10）（李小鈴等，2019）。各微生物均采用菌落計數法計數，將稀釋液涂布于MRS固體培養基，37℃下厭氧培養72 h，統計乳酸菌菌落數；在馬鈴薯葡萄糖培養基上涂布稀釋液，25℃下有氧培養72 h后統計酵母菌菌落數；于馬丁培養基上涂布稀釋液，25℃下有氧培養72 h，統計霉菌菌落數。

1.3.3 發酵品質測定包括pH、氨態氮（Ammonium nitrogen，NH-N）、乳酸、乙酸、丙酸和丁酸。pH采用酸度計（PHS-25）測定；NH-N含量采用苯酚—次氯酸鈉比色法分析，乳酸及有機酸采用高效液相色譜法分析（Broderick and Kang，1980）。

1.3.4 營養成分測定包括干物質（Dry matter，DM）、粗蛋白質（Crude protein，CP）、可溶性碳水化合物（Water-soluble carbohydrates，WSC）、酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）和中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）。DM和CP含量參照AOAC（2005）的方法測定，其中DM采用烘干重量法，CP采用凱氏定氮法；WSC含量采用蒽酮—硫酸比色法（Dubois et al.，1956）測定，ADF和NDF含量采用范氏洗滌纖維法（van Soest et al.，1991）測定。

1.4 統計分析

使用Excel 2007對試驗數據進行整理。采用SPSS v18.0進行單因子方差分析，并用鄧肯氏法進行組間差異顯著性分析。根據試驗數據分析結果，用模糊數學隸屬函數法對青貯60 d的感官品質、發酵品質、營養成分和微生物數量指標進行綜合評價（苗芳等，2017），計算公式如下：

式中，為各指標正相關隸屬函數值，為各指標負相關隸屬函數值，為某指標測定值，和分別為某指標所有測定值中的最小值和最大值。以全部指標隸屬函數值平均值大小進行排名。

2 結果與分析

2.1 單一和復合乳酸菌添加對高丹草青貯感官品質的影響

由表1可知，高丹草青貯發酵后，各處理均無酸臭味，莖葉結構保持較好，無腐敗變質現象，LP06和F-1處理具有明顯芳香果味，質地結構柔軟松散，感官評分17分，感官品質優于其他處理。CK和LBR02處理葉片柔軟但稍粘手，感官評分14分，青貯品質等級為良。

2.2 單一和復合乳酸菌添加對高丹草青貯主要微生物數量的影響

單一和復合乳酸菌添加對高丹草青貯主要微生物數量的影響效果見表2。高丹草乳酸菌初始數量較少，為3.61×10CFU/g，青貯后，全部處理附著的乳酸菌數量均顯著高于青貯前乳酸菌數量（＜0.05，下同）；7個乳酸菌添加處理的乳酸菌數量也顯著高于CK，其中LP06、F-1和F-4處理乳酸菌增殖效果最佳，數量均在7.00×10CFU/g以上，顯著高于CK、LBR02和F-3處理。青貯60 d后，各處理酵母菌數量顯著下降，其中LBR02、F-2和F-3處理未檢測到酵母菌，酵母菌生長得到有效抑制。各處理霉菌數量顯著下降，LP06、LBR02、F-2和F-3處理未檢測到霉菌。綜上，F-2處理有效增加高丹草青貯乳酸菌數量的同時，能顯著抑制酵母菌和霉菌生長繁殖，微生物菌群整體表現最佳。

表1 不同菌劑添加對高丹草青貯感官評分的影響Table 1 Effects of adding different bacteria agents on sensory score of S.bicolor×S.sudanense silage

表2 不同菌劑添加對高丹草青貯60 d后主要微生物數量的影響（×105CFU/g）Table 2 Effects of adding different bacteria agents on major microbial quantity of S.bicolor×S.sudanense after 60 d silage（×105CFU/g）

2.3 單一和復合乳酸菌添加對高丹草營養成分的影響

由表3可知，高丹草青貯60 d后，8個處理的DM含量均有所下降，但青貯前后差異不顯著（＞0.05，下同）。各處理CP營養有不同程度損失，7個乳酸菌添加處理CP含量顯著高于CK，其中F-2處理CP含量較CK高10.2%。各處理WSC含量較青貯前大幅下降，降幅為52.34%～68.54%，其中CK的WSC營養損失最少，WSC含量為5.09%，顯著高于7個乳酸菌添加處理，LP06、F-1、F-2和F-4處理營養損失最大，顯著低于其他處理。青貯前后，各處理ADF和NDF含量變化不顯著。

2.4 單一和復合乳酸菌添加對高丹草發酵品質的影響

單一和復合乳酸菌添加對高丹草青貯發酵品質的影響效果見表4。青貯60 d后，F-2處理pH表現最優，為3.88。CK的NH-N含量顯著高于7個乳酸菌添加處理，含量最低的為F-2處理（0.086%），各乳酸菌添加處理之間NH-N含量差異不顯著。青貯發酵顯著提高高丹草乳酸含量，各乳酸菌添加處理乳酸含量顯著高于CK，其中LP06和PP02處理的乳酸含量最高，分別為4.21%和4.03%，顯著高于其他處理。全部處理乙酸含量相對發酵前顯著增加，其中LBR02、F-2、F-3和F-4處理乙酸含量顯著高于CK和其他3個同型發酵乳酸菌處理，以LBR02處理乙酸含量最高，為2.20%。高丹草青貯發酵前后均未檢測到丙酸和丁酸。從發酵品質上看，F-2處理顯著降低pH和NH-N含量的同時，有效提高青貯飼料乳酸和乙酸含量，發酵品質最佳。

2.5 單一和復合乳酸菌添加對高丹草青貯效果的綜合評價

為全面評價各菌劑添加處理對高丹草青貯感官品質、發酵品質、營養成分和微生物數量影響的綜合效果，利用隸屬函數法對8個處理進行綜合評定，其中感官品質、乳酸、乙酸、DM、CP、WSC含量和乳酸菌數量與發酵效果呈正相關，為正向指標，pH、NH-N、NDF、ADF含量及酵母菌、霉菌數量與發酵效果呈負相關，為負向指標，各處理均未檢測出丙酸和丁酸，不納入評價指標。以7個正向指標和6個負向指標的隸屬函數值進行綜合價值評定，隸屬函數平均值越高表明該處理青貯效果綜合表現越好，8個處理得分從高至低依次為：F-2處理（0.69）＞LP06處理（0.65）＞F-1處理（0.56）＞PP02處理（0.55）＞F-3和F-4處理（0.52）＞LBR02處理（0.51）＞CK（0.23）（表5）。

表3 不同菌劑添加對高丹草青貯60 d后營養成分含量的影響（%）Table 3 Effects of adding different bacteria agents on nutritional component of S.bicolor×S.sudanense after 60 d silage（%）

表4 不同菌劑添加對高丹草青貯60 d后發酵品質的影響Table 4 Effects of adding different bacteria agents on fermentation quality of S.bicolor×S.sudanense after 60 d silage

表5 不同菌劑添加對高丹草青貯發酵效果的綜合評價Table 5 Effects of adding different bacteria agents on comprehensive evaluation of fermentation of S.bicolor×S.sudanense silage

3 討論

3.1 不同類型乳酸菌添加對高丹草主要微生物數量和感官品質的影響

劉晗璐（2008）研究指出，因新鮮牧草中附著大量酵母菌、霉菌等好氧微生物，乳酸菌數量一般需達5×10CFU/g以上才易保障青貯發酵質量。本研究中高丹草初始乳酸菌數量僅為3.61×10CFU/g，含量低于酵母菌和霉菌總量7.46×10CFU/g。當牧草表面附著的乳酸菌數量過低時，可額外添加乳酸菌主導發酵以增加優勢菌群，加速青貯發酵進程，抑制有害菌繁殖，降低營養損耗，從而獲得優質的牧草青貯（李小鈴等，2019）。本研究中，青貯60 d后的高丹草乳酸菌數量較青貯前大幅增加，以植物乳桿菌LP06單獨添加和LP06與戊糖片球菌PP02復合添加增殖效果表現最優。李小鈴等（2019）在單一和復合乳酸菌添加對扁穗牛鞭草青貯品質的影響中指出，植物乳桿菌單一添加乳酸菌增殖效果最佳，數量最多。

Filya（2003）在玉米和高粱的乳酸菌配比添加試驗中指出，不同乳酸菌添加比例對乳酸菌的增殖速度有不同影響，一般同型發酵乳酸菌生長速度快于異型發酵乳酸菌，本研究結果也進一步證明了同型發酵乳酸菌在主導青貯發酵方面的優勢。高丹草青貯60 d后，短乳桿菌單獨添加、短乳桿菌+植物乳桿菌、短乳桿菌+戊糖片球菌3個處理均未檢測出酵母菌和霉菌，對有害微生物的生長抑制效果顯著。短乳桿菌LBR02是異型發酵乳酸菌，異型發酵乳酸菌在青貯過程中能產生大量乙酸，對提高青貯有氧穩定性、抑制有害菌生長有促進作用（塔娜等，2017；賈婷婷等，2018）。

青貯飼料的氣味、色澤和結構等感官品質在一定程度上能反映青貯發酵優劣。LP06和F-1處理感官評定最優，與這2個處理乳酸含量和乳酸菌數量檢測結果相吻合，表明以植物乳桿菌主導青貯發酵，能在發酵前期快速形成優勢菌種，從而更易保障發酵的感官品質。短乳桿菌LBR02單一添加或與戊糖片球菌PP02以1∶1比例復合添加，在氣味評分上得分較低，可能與短乳桿菌代謝有關，其合成自身氨基酸時分解蛋白質產生部分具有不良氣味的氨和胺類物質（Juracek et al.，2018）。

3.2 不同類型乳酸菌添加對高丹草營養成分的影響

營養成分是評定青貯質量的關鍵指標，一般認為青貯飼料DM、WSC和CP含量與青貯質量呈正相關，含量越高，青貯質量越好。李小鈴等（2019）研究表明，異型發酵乳酸菌食竇魏斯氏菌添加組青貯發酵的DM含量最高。張凡凡等（2021）利用纖維素分解菌與布氏乳桿菌聯合接種，發現布氏乳桿菌可顯著提高青貯玉米DM含量。本研究各處理間DM含量差異不顯著，4個異型發酵短乳桿菌添加處理均未在DM含量上表現出明顯優勢，與李小鈴等（2019）、張凡凡等（2021）的研究結果不一致，可能是因為不同發酵類型乳酸菌的不同比例、種類組合或受發酵底物影響，均會表現出不同的協同作用所致，但菌株之間、菌株與底物代謝間如何協同作用還需深入研究。

高丹草發酵60 d后，8個處理的CP含量同青貯前相比均出現不同程度降低，推測可能是發酵初期，體系內酸性環境尚未形成，蛋白質分解酶和部分微生物代謝活躍導致蛋白質快速分解所致（韓立英等，2013）。高丹草青貯60 d后，各處理CP含量較青貯前顯著下降，可能與高丹草青貯后的呼吸作用、蛋白質分解酶和相關微生物代謝活動有關（韓立英等，2013），7個乳酸菌添加處理的CP含量均顯著高于CK，也進一步證實了添加乳酸菌在抑制高丹草蛋白質降解方面的優勢。青貯發酵時微生物需要能量來源以保證自身生長，WSC作為乳酸菌生長碳源攝取的主要底物，在青貯過程中被乳酸菌代謝消化，其含量可間接反映乳酸菌生長情況。本研究中，高丹草青貯60 d后，CK、戊糖片球菌和短乳桿菌單獨添加或這2種菌復合添加的WSC含量顯著高于其他處理，可能與這4個處理乳酸菌代謝活動相對較弱、WSC分解消耗較慢有關。NDF作為飼料纖維質量判定的有效標準，其含量高低可初步估測日糧精粗比例是否合理；ADF是飼料能值的重要評判指標，其含量與青貯飼料的飼用價值成反比。尤思涵等（2021）在高丹草與黑麥草混貯研究中指出，不同混貯比例的NDF和ADF含量存在明顯差異，本研究中8個處理的ADF和NDF含量變化不顯著，與尤思涵等（2021）的研究結果不一致，推測原因可能與發酵底物有關，本研究發酵底物為高丹草單貯，尤思涵等（2021）報道為高丹草與黑麥草混合青貯，混合青貯在一定程度上改變了營養物質的比例。

3.3 不同類型乳酸菌添加對高丹草發酵品質的影響

pH、NH-N、乳酸和乙酸含量是評判青貯發酵效果的關鍵指標。pH大小直接反映青貯飼料是否處于良好的酸性環境，對底物發酵至關重要，一般認為優良的青貯飼料pH為3.8～4.2。本研究中，全部同型發酵乳酸菌添加處理的pH均低于短乳桿菌LBR02單獨添加處理，進一步體現了同型發酵乳酸菌在提升發酵進程方面的優勢作用。研究表明，隨著發酵進行，蛋白質被多種好氧微生物代謝繁殖所消耗，亦或通過不同途徑被分解轉化成NH-N和胺類物質，NH-N含量越高，間接反映底物蛋白質消耗越多（蔣蘇蘇等，2017）。一般認為NH-N含量≤5%，青貯發酵品質優良。本研究中，所有處理的NH-N含量極低，推測原因，一方面蜀草1號高丹草屬高光效C4植物，WSC含量較高，豐富的WSC含量為青貯發酵提供了充足的碳源，各處理體系內乳酸菌群快速增殖形成酸性環境，pH均≤4.10，達優良飼草發酵pH，良好的酸性環境有效抑制了有害微生物對蛋白質的分解消耗；另一方面，可能與蛋白分解酶活性有關，隨著pH降低，蛋白酶活性極大降低，很大程度上減少NH-N含量。

前人研究結果（王旭哲等，2018；徐生陽等，2019）表明，同型、異型乳酸菌單獨添加或復合添加，均可獲得較高的乳酸含量，且顯著高于CK。同型、異型發酵乳酸菌生長代謝均可產生大量乳酸。本研究所用發酵底物高丹草的乳酸菌初始數量較低，自然發酵乳酸濃度增加較慢，乳酸菌添加后快速生長代謝，進而顯著提高乳酸含量，與pH試驗結果相吻合。除F-4處理外，其余3個異型發酵乳酸菌添加處理乙酸含量顯著高于其他處理，其中短乳桿菌單獨添加含量最高。黃峰等（2019）、李菲菲等（2019）研究指出，短乳桿菌、布氏乳桿菌和希氏乳桿菌等眾多異型發酵乳酸菌不僅能產生乳酸，還會產生乙酸等抑制有害微生物生長的有機酸，LBR02、F-2和F-3 3個短乳桿菌添加處理的乙酸測定結果與酵母菌、霉菌抑制效果相一致，而F-4乙酸含量顯著低于這3個處理，可能與短乳桿菌添加比例較低，生長代謝受影響有關。

4 結論

青貯60 d時，同型發酵乳酸菌LP06添加在提高高丹草青貯感官品質、降低NH-N含量、減少CP損失、增加乳酸含量和乳酸菌數量上表現更具優勢，異型發酵乳酸菌LBR02在抑制有害微生物生長方面作用更顯著。綜上分析，植物乳桿菌LP06與短乳桿菌LBR02按1∶1比例復合添加，高丹草青貯效果綜合表現最優。