桉蝙蛾幼蟲對桉樹樹干及其林下淺層土壤揮發物的嗅覺行為反應

許原，張玉靜，熊運凡，黃穎，鐘聲，朱昭華，楊振德，胡平*

（1廣西大學林學院，廣西南寧530004；2廣西大學農學院，廣西南寧530004；3廣西國有博白林場，廣西玉林537600）

0 引言

【研究意義】桉蝙蛾（Walker）隸屬鱗翅目（Lepidoptera）蝙蛾科（Hepialidae），是我國本土多食性害蟲和重大林木鉆蛀性害蟲（楊秀好等，2021）。桉蝙蛾初孵幼蟲在林下腐殖質層生活，3齡幼蟲從林下腐殖土轉移上樹，在蛀道口環狀蛀食韌皮部，且蛀道不再愈合，使速生桉木材材質受損，嚴重的導致整株枯死或風折，造成重大經濟損失（楊秀好，2013）。由于桉蝙蛾為害隱蔽，通常發現受害時間晚，防治困難，傳統的人工物理及化學方法耗時耗力且效率低。近年來，利用植物揮發物進行害蟲防治已有較多研究（陳元生等，2014；邱樂和王占娣，2019；呂建華等，2020；楊靜美等，2020），將寄主植物揮發物制成植物源引誘劑具有環保、經濟、生態控制等優點，具有廣泛的應用前景（向玉勇等，2015；楊真等，2015）。因此，利用植物揮發物開發桉蝙蛾植物源引誘劑，對桉蝙蛾的防控具有重要意義。【前人研究進展】大量研究發現，植食性昆蟲會對寄主植物釋放的某些特異性化合物產生趨向行為（杜家緯，2001；嚴善春等，2003）。Wang等（2017）研究發現榆樹揮發物（1）-（+）--蒎烯能顯著吸引榆紫葉甲成蟲（）；興安落葉松揮發物3-蒈烯和水芹烯對松癭小卷蛾成蟲（）具有吸引作用（狄貴秋等，2019）；油松和樟子松揮發物（+）-3-蒈烯對紅脂大小蠹（）雌成蟲有明顯的吸引作用（劉敏等，2021）。成熟的巴特利特梨揮發物（2,4）-2,4-癸二烯酸乙酯對蘋果蠹蛾（）幼蟲有較強的吸引作用（Knight and Light，2001）；紅松健康球果揮發物-蒎烯可顯著吸引松果梢斑螟（）幼蟲（杜秀娟等，2010）。蟲害誘導植物揮發物（Herbivore-induced plant volatiles，HIPVs）是植物受到植食性昆蟲危害后所釋放的揮發物，其在組分和含量等方面均與健康植物揮發物存在差異（婁永根和程家安，2000；黃安平，2014；王冰等，2021）。有研究發現，HIPVs會對一些植食性昆蟲產生趨避行為（婁永根和程家安，2000；De Moraes et al.，2001；Rostas and Hilker，2002），這種行為可避免與同類競爭以及減小被天敵捕食或寄生的風險（Zalucki et al.，2002）。然而，隨著研究的深入，發現在有些鱗翅目幼蟲中同種蟲害誘導植物揮發物相較于健康植物揮發物對其更具吸引力。Landolt等（2000）研究發現，已被蘋果蠹蛾幼蟲侵染的蘋果果實比未被侵染的果實能吸引更多的蘋果蠹蛾幼蟲；在一項家蠶（）嗅覺行為試驗中，證實已被同種幼蟲取食的桑葉相較未受損的桑葉有更好的引誘效果（Mooney et al.，2009）；草地貪夜蛾（）幼蟲從卵團到分散取食的行為過程中，會利用被同種昆蟲取食誘導的植物揮發物作為寄主植物定位和識別的線索（Carroll et al.，2008）。【本研究切入點】楊秀好（2017）調查發現，在一片8種樹種混交的桉樹林中，有70%的桉樹受到桉蝙蛾幼蟲為害而其他樹種未受害，據此推測，桉蝙蛾幼蟲從土壤轉移到樹干危害時，桉樹樹干揮發物對桉蝙蛾幼蟲具有引誘作用；同時，林間常見多只桉蝙蛾幼蟲聚集危害同一株桉樹，且桉蝙蛾幼蟲危害桉樹后形成的木屑包周圍也會發現低齡桉蝙蛾幼蟲（楊秀好，2013）。目前，受桉蝙蛾危害后的桉樹樹干是否會產生吸引其他個體的揮發物尚不明確。【擬解決的關鍵問題】采用動態頂空吸附和氣相色譜—質譜聯用（GC-MS）技術對健康和受桉蝙蛾危害桉樹樹干以及桉樹林淺層土壤晝夜釋放的揮發物進行收集、鑒定和比較，運用隨機森林算法篩選出重要的化合物；選擇轉移危害時的桉蝙蛾3齡幼蟲進行Y型嗅覺儀行為測定，探究桉蝙蛾幼蟲尋找寄主時土壤與桉樹樹干揮發物的狀況，以及健康桉樹樹干與受桉蝙蛾幼蟲危害桉樹樹干揮發物的差異，以探索桉蝙蛾幼蟲由地棲環境向樹棲危害的轉移機制，為林間桉蝙蛾幼蟲的生態防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年7—10月（桉蝙蛾幼蟲上樹時期）在廣西南寧市高峰林場進行。選擇胸徑90 mm未被桉蝙蛾危害且長勢良好的桉樹作為健康桉樹；在健康樹旁，選擇受單頭桉蝙蛾危害的桉樹作為受害桉樹；取桉樹林林地淺層腐殖土（50 mm）作為供試淺層土壤。

供試桉蝙蛾3齡幼蟲均采自高峰林場，采集剛蛀入桉蝙蛾3齡幼蟲的桉樹帶回實驗室，將樹干劈開取出幼蟲置于培養皿中，供給半人工飼料飼養，以備嗅覺行為研究。飼養條件為室內自然光照、溫度、濕度。

1.2 試驗方法

1.2.1 揮發性物質的采集參考管維康等（2020）的方法，采用動態頂空吸附技術收集揮發物。使用透明烤箱袋（聚對苯二甲酸乙二酯，Jumbo，US）套住待測樹干（淺層土壤），上下兩端留進氣口和出氣口并墊上脫脂棉，使用橡膠皮筋和透明膠帶綁緊密封，進氣端依次連接裝有活性炭的洗氣瓶和裝有超純水的玻璃瓶作過濾空氣用，出氣端依次連接1.0 g裝有Porapak Q吸附劑（80/100 mesh，CNW，Irelan）的吸附玻璃管和空氣流量計，整套裝置全部采用Teflon（四氟乙烯）管連接，進氣口和出氣口均連接在QC-1S大氣采樣儀（北京市勞保所科技發展有限責任公司）上。每隔12 h更換一次帶有吸附劑的玻璃管，將晝夜的樣品濃縮后混合成該處理24 h的揮發物樣品，每處理3次重復。

1.2.2 揮發性物質組分鑒定使用氣相色譜—質譜聯用儀（7890B-7000D，Agilent，US）分析鑒定揮發性物質。色譜柱為HP-5毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；升溫程序：起始溫度40℃，保持1 min，5℃/min升溫至160℃，然后10℃/min升溫至250℃。質譜電離方式為EI，電子能量70 eV，掃描質量范圍50～550 amu，載氣為氦氣（流速1 mL/min）。利用NIST17譜庫檢索，結合人工讀圖分析鑒定揮發物的組成成分。采用峰面積歸一法進行相對百分比定量。

1.3 統計分析

參考Mccormick等（2016）的方法，利用R Studio（R軟件包randomForest）對揮發物數據進行隨機森林（Breiman，2001）分析。隨機森林算法可計算出每個化合物的平均準確性下降（Mean decrease in accuracy，MDA）和不同試驗處理的出袋錯誤率（Out-ofbag，OOB），MDA是對每個化合物的重要性估計，MDA越高，化合物被認為越重要，OOB是測量隨機森林算法的預測誤差的值。桉蝙蛾幼蟲對揮發物的選擇反應率利用χ檢驗比較差異顯著性（0.05）。

1.4 桉蝙蛾3齡幼蟲對不同揮發物的行為選擇

根據隨機森林算法分析結果，選擇5種化合物作為刺激樣品于室內進行桉蝙蛾幼蟲的行為選擇試驗。以正己烷為溶劑，將5種化合物單體配制為10 mg/mL的溶液。

利用Y型嗅覺儀測定桉蝙蛾3齡幼蟲的行為反應。參照管維康等（2020）的方法，嗅覺儀測試臂長15 cm，主臂20 cm（內徑2.5 cm），兩臂夾角60°，測試臂兩端分別與味源瓶相連，采用QC-1S大氣采樣儀供氣，氣體通過活性炭和超純水后，經過味源瓶進入側臂，從主臂流出。測試開始前，先將待測桉蝙蛾3齡幼蟲置于試驗所在室內玻璃培養皿適應30 min。取10μL的待測溶液均勻滴到0.5 cm×2 cm的濾紙上，待溶劑揮發后放入味源瓶中，以10μL的正己烷為對照，控制氣體流速為400 mL/min。將待測的桉蝙蛾3齡幼蟲單頭引入Y型嗅覺儀的主臂口處后開始計時，觀察記錄2 min內桉蝙蛾3齡幼蟲對兩臂氣味源的選擇行為反應，若待測桉蝙蛾3齡幼蟲爬行超過某側臂1/2長度，且停留15 s以上者，記錄為該桉蝙蛾3齡幼蟲選擇此氣味源，2 min內未能作出選擇反應的記為不反應。每種氣味源測試30頭桉蝙蛾3齡幼蟲。每次測試完成后，用無水乙醇徹底清洗Y型玻璃管內壁，并用吹風機吹干，以消除殘留氣味的影響。每側試5次更換一次味源瓶位置，避免方向偏好。由于桉蝙蛾幼蟲活動高峰期在21：00—23：30，因此測試時間為21：00—23：30；溫度為25～28℃；觀察光源為紅光。

2 結果與分析

2.1 桉樹樹干及其林下淺層腐殖土揮發物組分及相對含量

由圖1和表1可看出，健康桉樹樹干揮發物中共鑒定出17種物質，其中萜烯類物質9種（相對含量87.85%）、芳香族類物質3種（相對含量5.44%）、烷烴類物質2種（相對含量1.25%）、醇類物質1種（相對含量0.63%）、酯類物質1種（相對含量2.81%）、醚類物質1種（相對含量2.02%），其中左旋--蒎烯相對含量最高，占總揮發物的55.96%，其次是3,3-二甲基-6-亞甲基環己烯（18.59%）和左旋--蒎烯（5.51%）。受害樹干揮發物中共鑒定出47種物質，其中萜烯類物質19種（相對含量74.50%）、芳香族類物質7種（相對含量11.15%）、烷烴類物質8種（相對含量1.28%）、酮類物質4種（相對含量5.16%）、醇類物質4種（相對含量4.06%）、醛類物質2種（相對含量0.89%）；酯類物質1種（相對含量1.94%）、酚類物質1種（相對含量1.03%）、醚類物質1種（相對含量0.03%），其中左旋--蒎烯相對含量最高，占52.62%，其次是-水芹烯（14.55%）和鄰傘花烴（6.93%）。桉樹林淺層土壤揮發物中共鑒定出23種物質，其中萜烯類物質9種（相對含量66.80%）、芳香族類物質9種（相對含量32.13%）、烷烴類物質3種（相對含量0.48%）、酮類物質2種（相對含量0.62%），其中桉葉油醇相對含量最高，占總揮發物的40.35%，其次是鄰二乙基苯（21.51%）和左旋--蒎烯（19.72%）。

2.2 桉樹樹干及其林下淺層腐殖土揮發物重要性分析

揮發物的組分及含量在桉蝙蛾幼蟲選擇寄主中發揮著重要作用。為區分不同處理的揮發物，采用機器學習算法中的隨機森林，利用MDA區分每種化合物的重要性，以OOB表示算法的預測誤差。利用隨機森林分析比較健康與受桉蝙蛾危害的樹干揮發物，算法預測誤差為0，發現有3種萜烯類化合物MDA值在前50%，分別為左旋--蒎烯、3,3-二甲基-6-亞甲基環己烯和左旋--蒎烯，剩余揮發物的相對重要性偏低（圖2）。將受害與健康桉樹樹干揮發物歸為一類（桉樹樹干揮發物），采用隨機森林分析比較桉樹樹干與淺層土壤揮發物，算法預測誤差為0，發現有5種萜烯類和1種芳香族類化合物MDA值在前50%，分別為左旋--蒎烯、莰烯、桉葉油醇、鄰傘花烴、3,3-二甲基-6-亞甲基環己烯和左旋--蒎烯，其余揮發物的相對重要性較弱（圖2）。

2.3 桉蝙蛾3齡幼蟲對5種揮發物的嗅覺行為反應

通過隨機森林算法篩選出5種化合物（左旋--蒎烯、左旋--蒎烯、莰烯、桉葉油醇和鄰傘花烴）（表2），并測定桉蝙蛾3齡幼蟲對5種化合物的嗅覺行為反應。由圖3可知，桉蝙蛾3齡幼蟲對10 mg/mL的莰烯和鄰傘花烴表現出顯著的正趨向作用，其中對莰烯的反應與對照相比達顯著差異（χ=5.54，=0.019）（0.05），對鄰傘花烴的反應與對照相比達極顯著差異（χ=6.76，=0.009）（0.01），其余3種化合物對桉蝙蛾3齡幼蟲未產生明顯的引誘或驅避作用。

3 討論

本研究應用動態頂空吸附和氣相色譜—質譜聯用技術分析了健康和受桉蝙蛾幼蟲危害的桉樹樹干及其林下淺層土壤的揮發物成分。健康和受害桉樹樹干揮發物共鑒定出49種化合物，二者在組分和相對含量上存在差異，其中健康桉樹樹干揮發物的種類較少；利用隨機森林對二者進一步分析發現，左旋--蒎烯、3,3-二甲基-6-亞甲基環己烯和左旋--蒎烯的重要性較強，是區分健康與受害桉樹樹干揮發物的重要化合物。桉樹樹干受桉蝙蛾幼蟲危害后，左旋--蒎烯、3,3-二甲基-6-亞甲基環己烯和左旋--蒎烯的相對含量均有所下降，但-水芹烯、鄰傘花烴和莰烯等化合物的相對含量則明顯增加，且產生了一些微量揮發物，如萜類化合物3-蒈烯、芳香族類化合物2-乙基甲苯、酮類化合物對乙基苯乙酮等，推測這些微量揮發物可能不是桉蝙蛾幼蟲進行寄主選擇的特異性化合物，但也可為其他尋找合適寄主的桉蝙蛾幼蟲提供線索。桉樹林下淺層土壤揮發物共鑒定出23種化合物，與桉樹樹干揮發物（健康和受害）組分存在較大差異；利用隨機森林進一步分析發現，左旋--蒎烯、莰烯、桉葉油醇、鄰傘花烴、3,3-二甲基-6-亞甲基環己烯和左旋--蒎烯的重要性較強，是區分土壤與桉樹樹干揮發物的重要化合物。土壤揮發物中莰烯和桉葉油醇的相對含量均高于樹干，而左旋--蒎烯、鄰傘花烴、3,3-二甲基-6-亞甲基環己烯和左旋--蒎烯的相對含量均低于樹干。左旋--蒎烯和左旋--蒎烯是常見的植物揮發物，可引誘紅脂大小蠹、南松大小蠹（）、松墨天牛（）、光肩星天牛（）和青楊脊虎天牛（）等多種昆蟲（寧眺等，2006；嚴善春等，2006；范麗清等，2013；Munro et al.，2020；劉敏等，2021）。莰烯、桉葉油醇和鄰傘花烴廣泛存在于植物精油中（Golebiowski et al.，2008；Kim et al.，2011；Ghasemi Pirbalouti and Craker，2015；Jeon et al.，2017；Van et al.，2021）。研究發現，莰烯和桉葉油醇均對核桃緣吉丁（）成蟲具有吸引作用（崔亞琴和宗世祥，2021）。此外，莰烯對枸杞紅癭蚊（）雌蟲和松梢象（）也具有吸引作用（王琪等，2011；張凡等，2020），但對松毛蟲（）成蟲有顯著的驅避效果（林健等，2014）；桉葉油醇對黃地老虎（）、光材小蠹（）具有顯著吸引作用（Kuhns et al.，2014；李琳等，2020），且對馬鈴薯塊莖蛾（）的產卵行為具有引誘作用（劉燕等，2016）；鄰傘花烴可作為柳藍葉甲（）的引誘劑（Ling et al.，2021），而對西花薊馬（）有驅避作用（溫娟等，2015）；有關揮發物3,3-二甲基-6-亞甲基環己烯與昆蟲相互作用的研究較少，還有待發掘。通過隨機森林的結果，可初步推斷桉蝙蛾幼蟲可能利用嗅覺識別左旋--蒎烯、莰烯、桉葉油醇、鄰傘花烴、3,3-二甲基-6-亞甲基環己烯和左旋--蒎烯等6種化合物的組成及含量，而使其能在復雜的土壤環境中準確選擇桉樹進行為害。

行為選擇試驗結果表明，在10 mg/mL濃度下，莰烯對桉蝙蛾幼蟲有顯著的吸引作用，鄰傘花烴對桉蝙蛾幼蟲有極顯著的吸引作用。有研究發現，被草地貪夜蛾幼蟲取食后的玉米植株會產生更多的芳樟醇，能吸引其他草地貪夜蛾幼蟲（Carroll et al.，2006）；蘋果蠹蛾幼蟲取食蘋果果實后，受害果實會揮發出更多的-法尼烯，從而吸引其他蘋果蠹蛾幼蟲（Landolt et al.，2000）。本研究檢測到桉樹樹干受桉蝙蛾幼蟲危害后，鄰傘花烴和莰烯的含量均有所上升。莰烯在土壤揮發物中的相對含量最多且對桉蝙蛾幼蟲有顯著的吸引作用，可能是桉蝙蛾幼蟲對原有生境較熟悉的結果。鄰傘花烴在受害桉樹樹干中的含量最多，而在土壤揮發物中未檢測到，推測在桉蝙蛾幼蟲寄主識別過程中，鄰傘花烴的含量占據更重要地位。

本研究僅測試了單個桉樹樹干揮發物對桉蝙蛾幼蟲行為的影響。然而，昆蟲的行為反應可能會因背景氣味的改變而改變，即單一化合物引起的行為可能與混合物引起的行為存在差異（Beyaert et al.，2010；Webster et al.，2010）。此外，化合物濃度的增大或減小也會引起昆蟲的不同反應（Martin et al.，2011；Piesik et al.，2013）。因此，下一步可在不同濃度和不同化合物配比的條件下繼續開展桉蝙蛾幼蟲行為反應和野外生測試驗，為進一步開發桉蝙蛾植物源引誘劑打下理論基礎。

研究表明，雖然桉蝙蛾幼蟲的聚集行為或許存在加大種內競爭的強度以及增加被捕食的風險，但昆蟲幼蟲的行動和抵御天敵的能力較弱，其聚集行為有利于改善小氣候、提高取食效率以及降低寄主植物防御等優點，從而導致聚集行為較優先（Zalucki et al.，2002；Reader and Hochuli，2003）。此外，HIPVs可能攜帶寄主植物的質量信息而吸引其他同種幼蟲聚集（Robert et al.，2012；Shivaramu et al.，2017）。受害桉樹樹干揮發物可能也包含著類似的信息，導致桉蝙蛾幼蟲聚集行為的發生。而且，桉蝙蛾幼蟲選定寄主后不再轉移，這種聚集行為也有利于其羽化后能快速尋找到配偶。HIPVs在生態系統中具有吸引天敵、趨避或吸引同種昆蟲以及作用于植物之間的交流等多種功能（婁永根和程家安，2000；Arimura et al.，2009；黃安平，2014；王冰等，2021），后續將繼續探究HIPVs在不同生態位的作用，從而構建一種更加安全、有效的害蟲管理方法。

4 結論

桉樹樹干揮發物中的鄰傘花烴和莰烯均可顯著吸引桉蝙蛾3齡幼蟲，且均在受害桉樹樹干揮發物中含量更高，推測二者對桉蝙蛾幼蟲尋找寄主植物的行為具有調控作用。