水稻WOX家族基因鑒定及其種子在逆境萌發(fā)中的表達分析

張琪，張愛霞，賈俊婷，趙華，劉軍*，陳兵先*

（1廣東省農業(yè)科學院農業(yè)生物基因研究中心/廣東省農作物種質資源保護與利用重點實驗室，廣東廣州 510640；2廣州國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)科技創(chuàng)新中心/農業(yè)農村部華南現(xiàn)代生物種業(yè)重點實驗室，廣東廣州 510520）

0 引言

【研究意義】水稻（L.）作為主糧作物在保障我國糧食有效供給中發(fā)揮重要作用，其種子萌發(fā)和成苗質量在很大程度上決定著植株的營養(yǎng)狀況和產量，因此，關于水稻萌發(fā)機理探究一直以來都是研究熱點之一（陳雅玲等，2020；常彥鵬等，2021；王丹丹和李娟，2021）。WOX（WUSCHELrelated homobox）蛋白是植物特有的轉錄因子，在植物干細胞穩(wěn)態(tài)維持、胚胎發(fā)生與胚胎后期發(fā)育、激素信號轉導、初生和次生物質代謝及抗逆響應中均發(fā)揮重要的調節(jié)作用（Wang et al.，2019；朱滿喜等，2020）。WOX蛋白含有60～66個氨基酸殘基組成的同源異型結構域，具有“螺旋—環(huán)—螺旋—轉—螺旋”結構，其中，第2個和3個螺旋組合形成的“螺旋—轉角—螺旋”能與特定DNA序列結合（Haecker et al.，2004；Mukherjee et al.，2009）。但目前家族基因在水稻生長發(fā)育和逆境脅迫下的功能仍不清楚，因此，鑒定水稻家族基因，并分析其在種子逆境萌發(fā)過程中的表達模式，對探究基因功能及培育水稻抗性品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】已有較多植物基因組中基因家族被鑒定，如從擬南芥（Lian et al.，2014）、番茄（李曉旭等，2016）、棉花（呂有軍等，2017）、玉米（鄭玲等，2019）、大豆（Hao et al.，2019）中分別鑒定獲得15、10、37、31和33個基因家族成員。近年來，較多非大宗作物的家族基因也被鑒定，如從苦蕎中鑒定獲得30個基因家族成員，不均勻分布在8條染色體上（候思宇等，2021）；從藜麥中鑒定獲得13個WOX轉錄因子，均含由34～60個氨基酸組成的Homeobox保守結構域（朱滿喜等，2020）；從中華獼猴桃中鑒定獲得16個WOX轉錄因子，均屬于Homodomain超家族，系統(tǒng)進化分析結果顯示其與菠蘿WOX轉錄因子的親緣關系最近，與番茄WOX轉錄因子的親緣關系最遠（付春等，2021）；從蘋果中鑒定獲得12個家族成員，其中，有11個基因分別定位在7條染色體上，1個基因未準確定位（王楚堃等，2019）。有關植物基因功能的研究較多。在擬南芥中，和冗余調控花瓣和葉片的發(fā)育（Vandenbussche et al.，2009），基因在維持維管形成層的干細胞數量和形態(tài)中發(fā)揮重要作用（Hirakawa et al.，2010）；基因受生長素誘導后在根中表達，推測其在維持根尖分生組織干細胞的穩(wěn)定性方面 發(fā) 揮 作 用（Gonzali et al.，2005；Sarkar et al.，2007）；和基因調控胚早期頂端子葉原基發(fā)育（Wu et al.，2007）。在水稻中，基因參與葉腋分生組織的形成（Tanaka et al.，2015）；基因在器官發(fā)育中發(fā)揮重要作用，包括葉片側軸生長和維管系統(tǒng)形成、小穗內外稃形態(tài)發(fā)生，以及分蘗和側根形成（Yoo et al.，2013）；基因促進水稻分生組織向未分化狀態(tài)轉化，其功能與細胞分裂素的作用有關（Ohmori et al.，2013）；基因沉默后主根數量顯著增加，而過表達該基因可顯著抑制主根伸長，說明該基因也與根的發(fā)育有關（Li et al.，2020）；基因表達下調會導致葉片發(fā)育嚴重缺陷，同時也降低了維管束發(fā)育過程中參與活性細胞分裂素合成基因的表達水平（Yasui et al.，2018）；和基因可能在重力刺激反應中發(fā)揮生長素下游靶標的作用，并在控制水稻分蘗角度過程中發(fā)揮冗余作用（Zhang et al.，2018）；基因在新生冠根中表達，隨后在根分生組織的細胞分裂區(qū)域表達，從而參與調控水稻冠根的發(fā)生和生長（Zhao et al.，2009）；和基因在調控水稻側根原基發(fā)育中發(fā)揮相反作用，基因過表達可促進側根直徑的增加，而突變體降低L型側根的直徑（Kawai et al.，2022）；干旱脅迫下水稻葉片和根中基因表達量上調，過表達基因可提高水稻的抗旱能力并可將開花期提早7～10 d（Minh-Thu et al.，2018）?！颈狙芯壳腥朦c】雖然已有研究發(fā)現(xiàn)，水稻基 因 家 族 具 有13個 成 員（Nardmann et al.，2007），且部分基因在水稻發(fā)育中的功能已明確，但鮮見關于水稻家族基因的生物信息學分析及其在種子逆境萌發(fā)過程中表達模式的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】對水稻家族基因進行鑒定，對其結構特征、進化關系、保守序列等進行生物信息學分析，并通過實時熒光定量PCR（qRTPCR）檢測其在種子萌發(fā)期的時空表達模式及非生物脅迫下的表達模式，為深入探究水稻基因家族的生物學功能及水稻品種的遺傳改良提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的水稻品種為日本晴，其種子為本課題組種植生產。主要試劑：通用植物RNA提取試劑盒（RP3302）購自北京百泰克生物技術有限公司；Rever-Tra Ace Qpcr RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒（FSQ-301）購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；2×RealStar Green Fast Mixture（A301-10）購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；其他生化試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器設備：Climacell人工氣候箱（MMM，德國）、Chemi-Doc XRS+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）、Nano-Drop ND2000超微量核酸蛋白分析儀（Thermo，美國）、實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）、電泳儀（Bio-Rad，美國）和PCR儀（Bio-Rad，美國）。

1.2 材料處理

選取100粒飽滿的水稻種子放入覆蓋兩層濾紙的透明方形發(fā)芽盒中，加入10 mL種子吸脹溶液（即ddHO），置于培養(yǎng)箱，光/暗為12 h/12 h，溫度設置為：28℃（對照，CK）、15℃（低溫處理，T1）和42℃（高溫處理，T2）。將10 mL ddHO（CK）、200 mL ddHO（水淹處理，T3）、10 mL 100 mmol/L NaCl（鹽處理，T4）、10 mL 20% PEG6000（干旱處理，T5）分別加入發(fā)芽盒中，置于培養(yǎng)箱28℃，分別于2 d取種子和5 d取幼苗，用于后續(xù)RNA提取和qRT-PCR檢測。

1.3 水稻WOX基因家族成員鑒定及進化分析

在植物信息數據庫（http：//plants.ensembl.org/index.html）中下載水稻全基因組DNA序列、蛋白序列、gff3文件和編碼區(qū)（CDS）序列。水稻、擬南芥、玉米、番茄和楊樹WOX轉錄因子的蛋白序列來自PlantTFDB（http：//planttfdb.gao-lab.org/）。利用在線軟件Pfam（http：//pfam.xfam.org/）、NCBI CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）和SMART（http：//smart.embl.de/）對候選序列蛋白質結構進行分析，剔除不含完整同源異型結構域的候選序列。利用MAGE 7.0中的ClustalW對上述物種中的基因家族成員進行多序列比對，以鄰接法（Nerghbor-joining）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并利用Evolview 2.0（https：//evolgenius.info//evolview-v2/#login）進行注釋。

1.4 水稻WOX基因家族成員理化性質分析

運用ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線工具分析水稻WOX家族蛋白的氨基酸序列長度、分子量和等電點（Gasteiger，2003）。利用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）對該家族蛋白進行亞細胞定位分析。

1.5 水稻WOX家族基因結構、染色體定位及蛋白結構域分析

利用在線網站GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制水稻基因家族成員的內含子、非編碼區(qū)（UTR）和外顯子結構圖。根據水稻全基因組測序信息和標注信息文件，對家族基因染色體位置可視化分析和精準定位，并利用MapChart作圖。利用在線軟件Pfam（https：//pfam.xfam.org/）和MEME（http：//meme-suite.org）對水稻WOX家族蛋白序列的保守基序和功能結構域進行分析，其中，MEME的參數設置Maxi-mum number of motifs為10，Occurrences of a single motif為zero or one per sequence。

1.6 水稻WOX家族基因啟動子順式作用元件分析

選取家族基因上游2000 bp的序列，利用在線工具plantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對其順式作用元件進行分析，參數為軟件默認，相關數據使用TBtools作圖。

1.7 水稻WOX家族基因組織表達分析

利用Genevestigator（https：//www.genevestigator.com/gv/）數據庫中的Os_51k基因芯片數據，選取種子萌發(fā)和發(fā)育過程中胚、胚乳、幼苗和葉片的基因轉錄表達數據，并繪制表達熱圖，分析水稻家族基因的組織及誘導表達譜。

1.8 水稻WOX家族基因在逆境脅迫下表達分析

1.8.1 RNA提取及反轉錄合成cDNA第一鏈具體步驟如下：運用植物總RNA快速提取試劑盒提取水稻種胚RNA，用NanoDrop分光光度計檢測RNA的濃度和質量。采用ReverTra Ace Qpcr RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.8.2 基因表達定量分析采用qRT-PCR檢測水稻種子在不同逆境脅迫下的相對表達量。qRT-PCR采用2×RealStar Green Fast Mixture（GenStar，A301-10）試劑盒。反應體系20.0μL：2×RealStar Green Fast Mixture 10.0μL，10μmol/L正、反向引物0.8μL，5 ng/μL cDNA模板2.0μL，ddHO補充至20.0μL。擴增程序：95℃，2 min；95℃，15 s；58℃，30 s；72℃，30 s，進行40個循環(huán)。每組試驗設3次生物學重復，相對定量用2計算。內參基因為。試驗引物序列見表1。

2 結果與分析

2.1 水稻WOX家族成員鑒定及系統(tǒng)進化分析結果

從PlantTFDB數據庫鑒定獲得13個水稻基因家族成員（～）。為了分析水稻家族基因的系統(tǒng)進化規(guī)律，選取基因序列信息較完整的擬南芥（16個）、玉米（20個）、番茄（10個）和胡楊（17個）的家族基因序列作為參考，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，如圖1所示。5個物種76條基因可聚為分成3個類群。根據模式植物擬南芥的分類標準（王俞程等，2015），將水稻基因家族成員分為遠古進化支（Ancient clade）、中間進化支（Intermediate）和現(xiàn)代進化支（WUS clade）。13個基因中僅有基因為遠古進化支，推測該基因編碼蛋白具有更為保守的結構和功能特性；中間進化支包含6個成員，分別是、、、、和基因。現(xiàn)代進化支也包含6個成員，分別是、、、、和基因，推測這6個基因是經漫長自然選擇后演化出來的基因。

2.2 水稻WOX基因結構分析及染色體定位結果

由圖2-A所示，是水稻基因家族中最長的基因，而、和為最短的基因。、、、和基因僅含有外顯子區(qū)域（CDS序列），無內含子和UTR區(qū)域；、和基因具有3個被內含子分割的外顯子區(qū)域，而、和基因具有較長的內含子序列。可見，水稻家族成員間基因結構存在較大差異，暗示水稻基因功能具有差異性和多樣性。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

圖1 基于不同物種WOX家族基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on WOX family gene sequence of different species

由圖2-B可知，13個基因不均勻地分布在水稻的1、3、4、5、7、8和11號染色體上，其余5條染色體上則不含該家族基因，其中1號染色體上的基因數量最多，含有4個成員；4和5號染色體上各有2個家族成員；3、8和11號染色體上各有1個基因分布，分別為、和。值得關注的是，和基因位于染色體的末端，只有和基因定位于染色體中端區(qū)域，說明大多數水稻基因家族成員傾向于分布在染色體的末端區(qū)域。

2.3 水稻WOX家族蛋白理化性質分析結果

通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，13個基因的編碼區(qū)（CDS）長度差異較大，為603～1602 bp，平均長度為931 bp，其編碼蛋白由200～533個氨基酸殘基組成，平均含有312個氨基酸殘基；相對分子量為22.35～54.80 kD，平均為33.24 kD；理論等電點（pI）為5.94～11.64，平均為8.16，其中遠古進化支的OsWOX8蛋白pI最小（5.94），為酸性蛋白，中間進化支的OsWOX13蛋白pI最大（11.64），分為堿性蛋白；13個水稻WOX家族蛋白均位于細胞核中（表2）。

2.4 水稻WOX保守結構域與保守基序分析

由圖3-A可知，水稻WOX家族蛋白共含有10個保守基序，其中OsWOX12蛋白所含的保守基序最多，共有7個保守基序，其次是OsWOX7和OsWOX10，包含6個保守基序；OsWOX8蛋白僅含有2個保守基序。一些保守基序僅存在于少數進化支中，如motif 6僅存在于現(xiàn)代進化支中，而Motif 3、Motif 4和Motif 7、Motif 8、Motif 9和Motif 10存在于中間進化支。值得關注的是，13個水稻WOX家族蛋白均具有Homodomain superfamily保守結構域，同時均含有Motif 1和Motif 2，而這2個保守基序正是蛋白保守功能域homeobox中的序列。由于OsWOX8蛋白的保守結構域中只含有Motif 1和Motif 2，表明這兩個基序是水稻WOX家族蛋白中最保守的序列。通過進一步分析發(fā)現(xiàn)，Motif 1末端含有8個連續(xù)高度保守的氨基酸：天冬酰胺（N）-纈氨酸（V）-苯丙氨酸（F）-酪氨酸（Y）-色氨酸（W）-苯丙氨酸（F）-谷氨酰胺（Q）-天冬酰胺（N）；motif 2的保守序列較短，前段含有2個保守氨基酸，即精氨酸（R）和色氨酸（W），中間含有一個保守的脯氨酸（P），中尾部含有一個保守連續(xù)的谷氨酸（E）-谷氨酰胺（Q）（圖3-B）。

圖2 水稻WOX家族基因結構（A）及染色體定位（B）結果Fig.2 Rice WOX family gene structure（A）and chromosome mapping（B）

2.5 水稻WOX家族基因啟動子區(qū)域的順式作用元件分析結果

由圖4-A可知，13個基因均含有較多的光響應元件及防御和脅迫相應元件，除基因以外，其他基因均含有干旱響應元件，85.0%的基因含有脫落酸響應元件和厭氧誘導元件，76.9%基因含有茉莉酸甲酯誘導元件，其次分布比例較多的是生長素響應元件、分生組織響應元件及乙烯和赤霉素響應元件。相比之下，其余元件在水稻基因家族中分布的數量和比例較低，比如高溫脅迫元件僅存在于基因啟動子區(qū)域中，而低溫脅迫元件只存在于基因中（圖4-A）。由上述推測，水稻基因家族成員主要在光合作用、生長發(fā)育、逆境脅迫、激素信號轉導等方面發(fā)揮重要調控作用。

對每個基因啟動子的順式作用元件進行深入分析，結果發(fā)現(xiàn)基因啟動子所含的順式作用元件最多，有37個，主要包括G-box、GATA-motif、MYB等光響應和防御脅迫響應的元件?；騿幼铀捻樖阶饔迷钌伲?0個，除含有較多的光響應和脅迫響應元件外，也含有4個厭氧響應元件（ARE）和2個生長素響應元件（TGA-element）。此外，種子特異性反應元件（RY-element）存在于、、和基因的啟動子中，推測這些基因參與水稻種子萌發(fā)的過程（圖4-B）。

2.6 水稻WOX家族基因在種子萌發(fā)及逆境脅迫下的表達情況

為了研究13個基因在水稻種子萌發(fā)和逆境脅迫下的轉錄水平，本研究從Genevestigator數據庫中獲取轉錄表達數據，并繪制基因表達熱圖。經檢索發(fā)現(xiàn)，該數據庫中僅存在9個基因的轉錄表達數據，未檢索到、、和基因的表達信息。由圖5-A可知，種子在萌發(fā)過程中，隨著種子吸脹時間的延長，基因在胚中的表達量呈先升高后降低的變化趨勢，但在胚乳中表達量較低；和基因在吸脹4～8 h的胚中表達量較高，之后呈下降趨勢，但二者在吸脹4～24 h的胚乳中表達量均較高；、和基因在吸脹4～24 h的胚和胚乳中表達量均較低。如圖5-B所示，低溫脅迫下，基因在2個水稻品種IR29和K354的葉片和幼苗中均有一定程度的表達；除和基因在冷脅迫8 h的葉片中表達量較高外，其他基因均呈現(xiàn)較低的表達量。綜上所述，、和在水稻種子萌發(fā)過程的表達量較高，可能是參與萌發(fā)過程的關鍵基因；而基因可能在水稻冷脅迫過程中發(fā)揮重要作用。

為進一步驗證探索家族基因在種子萌發(fā)、幼苗形成及逆境脅迫下的表達情況，以吸脹2 d水稻種子和5 d幼苗的水稻種子為材料，并加入逆境脅迫條件，采用qRT-PCR檢測13個基因的表達水平，結果如圖6所示。在CK組中，、和基因在2 d種子中的相對表達量較其在5 d幼苗中的相對表達量高，結合啟動子序列分析的

結果，推測三者是調控萌發(fā)過程的關鍵基因；、和基因在5 d幼苗中的相對表達量高于其在2 d種子中的相對表達量；其余基因在種子和幼苗的相對表達量均處于較低的表達水平（圖6-A）。和基因在干旱處理下表達上調，二者在干旱處理5 d幼苗中的相對表達量分別是CK組的15.0倍和8.0倍（圖6-B和圖6-C）?；蛟谘退幚? d幼苗和干旱處理2 d種子中表達下調，與CK組相比，其相對表達量分別下降了93.2%和87.2%（圖6-D）?；蛟诟邷靥幚硐卤磉_上調，其在5 d幼苗的相對表達量是CK組的2.7倍；基因在干旱處理2 d種子中相對表達量較CK組降低86.9%，但在干旱處理5 d幼苗中的相對表達量是CK組的3.9倍（圖6-E）?；虻谋磉_水平受干旱脅迫的影響較大，其在干旱處理2 d種子和5 d幼苗中的相對表達量分別是CK組的12.5%和3.6倍（圖6-F）。、和基因在干旱處理2 d種子中的相對表達量較

CK組降低39%、97.8%和61%，但在干旱處理5 d幼苗中的相對表達量有不同程度的升高（圖6-G、圖6-H和圖6-I）。此外，基因在高溫處理2 d種子中表達下調，其相對表達量比CK組降低90.1%（圖6-H）?；蛟诘蜏睾透珊堤幚? d種子中的相對表達量比CK組降低，但在高溫處理下相對表達量升高（圖6-J）?；蛟诟邷靥幚? d種子和5 d幼苗中的相對表達量是CK組的2.9倍和5.9倍，但其而在鹽脅迫處理5 d幼苗中相對表達量是CK組的5.0倍（圖6-K）?；蛟诟邷靥幚? d種子和5 d幼苗中的相對表達量分別是對照組的1.7倍和5.3倍（圖6-L）。基因在低溫和高溫處理2 d種子中的相對表達量分別是CK組的5.3倍和7.7倍（圖6-M）?；蛟邴}處理2 d種子和5 d幼苗的相對表達量是CK組的5.1倍和9.6倍（圖6-N）。綜上所述，13個基因在不同逆境脅迫下的轉錄表達特征存在明顯差異，表明水稻基因家族功能具有多樣性。

表2 水稻WOX家族蛋白成員信息Table 2 Information of rice WOX family protein member

圖3 水稻WOX家族蛋白保守基序（A）及序列標識圖（B）Fig.3 Rice WOX family protein conserved motif（A）and sequence identification diagram（B）

圖4 水稻WOX家族基因啟動子區(qū)域順式作用元件分析結果Fig.4 Cis-acting element analysis of rice WOX family genes

圖5 水稻在種子萌發(fā)期（A）和低溫脅迫（B）下WOX家族基因的轉錄表達水平Fig.5 Transcriptional expression level of WOX family genes during rice seed germination（A）and cold stress（B）

圖6 水稻種子逆境萌發(fā)過程中WOX家族基因的轉錄表達水平Fig.6 Transcriptional expression level of WOX family genes during rice seed germination under stress

3 討論

WOX是植物特有的轉錄因子，在植物干細胞的動態(tài)平衡調控、植物生長發(fā)育、組織器官的發(fā)生和形成及非生物脅迫響應中具有重要調節(jié)作用（Stahl et al.，2009；Ji et al.，2010；Katsir et al.，2011）。盡管部分水稻基因家族成員的功能已有報道，但有關水稻整個WOX家族基因的生物信息學相關分析及在種子逆境萌發(fā)過程中的表達情況未見報道。本研究結構域和基序分析結果表明，水稻13個WOX蛋白均Homodomain superfamily結構，與番茄（李曉旭等，2016）、葡萄（王鵬飛等，2018）、玉米（鄭玲等，2019）、獼猴桃（付春等，2021）等物種的WOX結構域類似，表明該結構域在不同物種間存在高度保守性；13個水稻WOX家族蛋白序列中均含有保守基序Motif 1和Motif 2，而這2個基序也正是保守蛋白結構域Homodomain的組成序列。與前人研究相比，水稻的保守結構域和保守基序與擬南芥和葡萄WOX家族蛋白（王鵬飛等，2018）類似，但與其他物種略有不同，如番茄（李曉旭等，2016）、蘋果（王楚堃等，2019）和中華獼猴桃（付春等，2021）的WOX家族蛋白的Homeodomain結構域中均含有Motif 1；毛竹WOX家族蛋白均含有Motif 1和Motif 3，這兩個保守基序共同組成Homodomain結構域（李晨曦等，2016）。參考模式植物擬南芥的分類標準（王俞程等，2015），本研究結合系統(tǒng)發(fā)育進化樹可知，水稻基因家族成員分為遠古進化支、中間進化支和現(xiàn)代進化支，與蘋果（王楚堃等，2019）、中華獼猴桃（付春等，2020）、苦蕎（侯思宇等，2021）等較多作物的家族基因系統(tǒng)分類結果一致，但毛竹基因家族基因系統(tǒng)分類結果（李晨曦等，2016）存在一定差異，即系統(tǒng)發(fā)育進化樹中只含有現(xiàn)代進化支和古老進化支，缺乏中間進化支。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在水稻古老進化支僅含基因，而在中間進化支和現(xiàn)代進化支均含有6個基因。該結果與藜麥的家族基因進化規(guī)律（即2個基因屬于遠古支，4個基因屬于中間支和7個基因屬于進化支）（朱滿喜等，2020）類似。

種子萌發(fā)和幼苗建成質量在較大程度上決定著作物生育后期的生物量和產量。研究發(fā)現(xiàn)，水稻（Chen et al.，2020）和（Cho and Paek，2016）基因參與初生根的伸長和根系建成，和基因控制水稻側根原基（LRP）大小（Katsir et al.，2022）。但關于水稻家族基因如何調控水稻種子萌發(fā)和幼苗生長的研究尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，基因在萌發(fā)種子和幼苗中的表達量均較高，、基因在萌發(fā)種子的表達量高于其在幼苗中的表達量，而、和基因在幼苗中的表達量高于種子中的表達量。結合水稻家族基因啟動子順式作用元件的分析結果，上述基因中的和基因存在種子特異性反應元件（RY-element），因此，推測這2個基因主要參與水稻種子萌發(fā)。低溫脅迫下，水稻萌發(fā)種子中和基因的表達量下調，而基因表達量上調，而其他基因的表達并未受到低溫脅迫的明顯影響。許多植物在低溫脅迫下家族基因表現(xiàn)相似的表達特征，如低溫脅迫下黃瓜葉片中基因的表達量升高，而、和基因的表達量下降（Han et al.，2021）；烏拉爾圖小麥在低溫脅迫下基因表達量顯著增加，、和基因表達量顯著降低（單強強等，2019）。但生長14 d的水稻幼苗在低溫處理6 h后，、、和基因表達量達較高水平（Cheng et al.，2014），與本研究結果有所不同，表明家族基因表達具有明顯的組織和時空表達特征。前人研究表明，在高溫和干旱脅迫下部分基因的表達呈現(xiàn)相似的表達模式，如基因在高溫和干旱脅迫下的表達量較高，過表達該基因可增強轉基因水稻幼苗的高溫和干旱抗性（Wu et al.，2009）。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下、、、和基因表達量不同程度的升高，但干旱脅迫下幼苗中、、、、和基因的表達量明顯升高，因此，和基因是在高溫和干旱脅迫下上調表達的基因。Kawai等（2022）研究也發(fā)現(xiàn)，水稻幼苗根中基因的表達量隨著干旱程度增加而升高。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下大多數基因表達量未發(fā)生明顯變化，僅5 d幼苗中、和基因的表達量有不同程度的升高，與Cheng等（2014）研究發(fā)現(xiàn)在高鹽脅迫下和基因在生長10 d的水稻幼苗中表達量顯著升高的結論相似。水淹脅迫是導致水稻生育過程中無氧呼吸的主要因素，許多應激蛋白基因在這一過程中表達（Osakabe et al.，2014）。本研究的13個基因中，僅基因的表達受到淹水脅迫抑制，基因在萌發(fā)種子中有一定程度的升高，而其他基因均未發(fā)生明顯變化，表明家族基因中僅有較少基因參與水稻淹水脅迫萌發(fā)過程。

4 結論

相較于擬南芥和玉米，水稻基因家族成員在系統(tǒng)發(fā)育進化上較先進，僅保留一個古老分支，且其啟動子區(qū)域均含有大量光響應和脅迫響應元件，推測水稻家族基因在功能上偏向于參與光合作用和逆境應答方面?；蛟谒痉N子萌發(fā)、幼苗及各種非生物脅迫下呈現(xiàn)豐富多樣的表達模式，其中，和基因為調控種子萌發(fā)的關鍵基因。