坡柳種子精油對5種植物病原真菌的熏蒸活性及化學成分分析

劉全俊，付立新，2，張揚，李豐超，于航，李金梁，秦小萍*

（1云南農業大學植物保護學院，云南昆明 650201；2德宏職業學院，云南芒市 678400；3云南農業大學水利學院，云南昆明 650201）

0 引言

【研究意義】立枯絲核菌（）、番茄灰霉病菌（）、尖孢鐮刀菌（）、芒果炭疽病菌（）、番茄早疫病菌（）是引起水果和蔬菜病害的重要病原真菌（吳瓊等，2018；郭敬等，2020；李其利等，2020；呼李樂等，2021；田春英等，2021），目前主要采用化學制劑防控上述病原菌引發的病害，但化學殺菌劑通常會對環境造成污染并引發病原菌的抗藥性，因而越來越多的學者致力于開發無污染、低毒和低殘留的合成殺菌劑替代品用于植物病原真菌控制。坡柳［（Linn.）Jacq.］又名車桑子，是無患子科（Sapindaceae）車桑子屬（）常綠灌木，其化學成分豐富，具有抗菌、抗病毒、抗炎和殺蟲等潛力（牛紅梅，2010）。因此，從具有良好應用前景的坡柳中提取種子精油并探究其抗菌活性物質，對植物病害防控，保障農作物安全生產具有重要意義。【前人研究進展】趙紅艷和楊美林（2006）采用菌落直徑法研究坡柳種子提取物對4種病原真菌［燕麥鐮刀菌（）、梨黑星病菌（VTanaka et Yamamoto）、煙草赤星病菌（）和番茄早疫病菌］菌落生長的影響，結果表明，乙醇提取物抑菌效果最好。趙紅艷等（2007）研究發現氯仿提取物對米象［（Linnaeus）］有顯著的觸殺活性。秦小萍等（2008a，2008b）研究報道坡柳種子乙醇提取物對小菜蛾［（L.）］4齡幼蟲具有很強的拒食作用，對高粱、小麥和稗草的幼根具有較好的抑制活性。Pirzada等（2010）用氯仿、乙醇、甲醇、乙酸乙酯和水提取坡柳葉片化學成分，并測試對黑曲霉（）、黃曲霉（）、擬青霉（）、石膏樣小孢子菌（）和紅色毛癬菌（）的抑制活性，結果發現氯仿提取物對供試真菌具有很強的抑制活性。吳道慧等（2014）及張余杰等（2014a，2014b）采用浸漬葉碟飼喂法測定坡柳皂苷對棉鈴蟲［（Hübner）］、大菜粉蝶（）、粘蟲［（Walker）］生長發育的影響，結果顯示，坡柳皂苷對棉鈴蟲、大菜粉蝶和粘蟲的生長發育有抑制作用，且隨濃度的增大而提高。代玉玲等（2015）采用無限量取食法、葉碟法和半葉法分別測定坡柳皂苷對果蠅（）的胃毒活性、小菜蛾幼蟲的非選擇性拒食活性及甘藍蚜蟲（）的選擇性拒食活性，結果表明，坡柳皂苷對果蠅和小菜蛾具有較好的生物活性，對甘藍蚜蟲的活性一般。張揚等（2018）采用小孔樹脂、凝膠Sephadex LH-20、反相色譜ODS及制備型高效液相色譜（PreHPLC）等分離技術從坡柳種子乙醇提取物中分離獲得1種活性化合物，測試發現其對小菜蛾3齡幼蟲具有較好的非選擇性拒食活性。Bimani和Hossain（2020）以正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取坡柳葉片中化學成分，并測試對5種細菌的活性，結果表明，乙酸乙酯和氯仿提取物的抑菌活性最高，而正己烷提取物的抑菌活性最低。胡棟寶等（2021）以車桑子種子為試材，采用超聲波輔助法提取總黃酮，并考察其體外抗氧化活性，結果表明，車桑子種子黃酮提取物對DPPH自由基和ABTS自由基具有較強的清除能力，且對Fe也具有較強的還原能力。于航等（2021）通過透射電鏡觀察了大菜粉蝶4齡幼蟲取食含坡柳皂苷葉碟后的中腸組織病理變化，結果表明，在1 mg/mL坡柳皂苷的作用下，大菜粉蝶幼蟲圍食膜和微絨毛消失，腸細胞與底膜分離，腔內出現大量空泡，溶酶體活動劇增，細胞器及細胞體出現自溶，光面內質網極度膨大。【本研究切入點】近年來對坡柳種子的報道多見于其溶劑提取物應用方面，對其精油的研究較少。【擬解決的關鍵問題】以坡柳種子為材料，采用同時蒸餾萃取法獲取坡柳種子精油，并用對扣熏蒸法測試其對5種植物病原真菌（立枯絲核菌、番茄灰霉病菌、尖孢鐮刀菌、芒果炭疽病菌和番茄早疫病菌）的抑制活性；通過氣相色譜—質譜聯用儀（GC-MS）進一步分析坡柳種子精油的化學成分，以期篩選出可有效防控植物病原微生物的天然產物，為下一步開發為植物源殺菌劑打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

坡柳種子購于云南生態技術有限公司，由云南農業大學植物學分類專家李孫文副教授鑒定，標本存放于云南農業大學植物保護學院化學樓生物農藥實驗室。供試菌株：立枯絲核菌、番茄灰霉病菌、尖孢鐮刀菌、番茄早疫病菌和芒果炭疽病菌均由云南農業大學植物保護學院農藥與化學生態實驗室提供，用PDA培養基培養保存。

主要儀器：SE602F型電子天平（上海洪紀儀器設備有限公司）；XL-60C粉碎機（廣州旭朗機械設備有限公司）；DHT型攪拌調溫電熱套（鄄城光明儀器有限公司）；HH-2數顯恒溫水浴鍋（常州市國華電器有限公司）；N-1100D型旋轉蒸發儀（上海市泉杰儀器有限公司）；DLSB-5L/20型低溫冷卻液循環泵（鞏義予華儀器有限公司）；SHZ-D（III）型循環水式真空泵（上海市子期實驗設備有限公司）；水蒸氣蒸餾裝置，本實驗室定制；安捷倫7890-5975N氣相色譜—質譜聯用儀（美國/安捷倫科技）。

主要試劑：1-辛烯-3醇（1-octen-3-ol）［含量98%，阿拉丁試劑（上海）有限公司］；亞油酸甲酯（Methyl linoleate）［含量98%，薩恩化學技術（上海）有限公司］；苯甲醛（Benzaldehyde）［含量99%，安耐吉（上海）有限公司］；-戊基丁內酯（-nonanolactone）（含量98%，薩恩化學技術有限公司）；2-正戊基呋喃（2-pentylfuran）［含量98%，阿拉丁試劑（北京）有限公司］；99%無水硫酸鈉（天津光復科技發展有限公司）；二氯甲烷（AR）（天津富宇精細化工有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 精油提取采用同時蒸餾萃取法，參照羅凱等（2012）的方法略作修改。稱取70 g坡柳種子放入1 L的物料瓶中，加入700 mL蒸餾水混合均勻，在物料瓶中加入少量沸石；用量筒量取250 mL二氯甲烷（分析純）加入另一500 mL平底燒瓶中；將物料瓶、燒瓶與水蒸氣蒸餾裝置固定連接，打開冷凝循環，打開電熱套開關，調節溫度，待第1滴餾出液滴下開始計時，蒸餾12 h后停止加熱；待裝置冷卻后，取下蒸餾裝置，向裝有二氯甲烷的燒瓶中加入過量無水硫酸鈉去水，振蕩搖晃，過濾；濃縮濾液得坡柳種子精油，計算得率。將精油保存在棕色瓶中，封口備用。

1.2.2 坡柳種子精油對5種植物病原真菌的熏蒸抑菌活性采用對扣熏蒸法（廖旺姣等，2014）測試精油對5種供試植物病原真菌的抑制活性；采用菌絲生長速率法測定精油對病原菌菌絲生長的抑制活性。無菌培養皿2個（內徑9 cm），一皿為PDA培養基，在培養基中央接入1個病原菌菌餅（直徑0.5 mm），另一皿為空白平板，分別設置10和50μL/L的一定體積的精油平均分布在濾紙片（直徑2 cm）上，兩皿合并（體積0.25 L）進行對扣熏蒸試驗，PDA平板在下，涂藥或空白平板在上。每種病原菌設1組對照，每處理3次重復。培養溫度為（25±1）℃、光周期L∶D=24 h∶0 h。采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率。

1.2.3 坡柳種子精油成分分析GC條件：HP-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；進樣口溫度230℃，檢測器溫度260℃；柱溫：初始溫度40℃，程序升溫5℃/min升溫至260℃，保持30 min；柱流量（Ne）為1.0 mL/min；柱前壓100 kPa；進樣量1.0μL；分流比10∶1；載氣為高純氦氣。

MS條件：電離方式EI；電離能量70 eV；離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，全掃描質量范圍50～550 m/z記錄質量譜；接口溫度280℃；流速1.0 mL/min；采用NIST 05標準譜庫計算機檢索定性。

1.2.4 坡柳種子精油的5種單體成分對5種植物病原真菌的熏蒸抑菌活性采用對扣熏蒸法：將1-辛烯-3-醇、亞油酸甲酯、苯甲醛、-戊基丁內酯和2-正戊基呋喃配置成50μL/L的溶液，測試對5種植物病原真菌的熏蒸抑制活性，測定方法同1.2.2。

1.2.5 坡柳種子精油的2種單體成分對5種植物病原真菌熏蒸抑菌活性的抑制中濃度（IC）采用對扣熏蒸法：將1-辛烯-3-醇和苯甲醛配置成系列梯度濃度，分別測試對5種植物病原真菌的IC，測定方法同1.2.2。

1.3 統計分析

采用Excel 2010進行數據整理，用SPSS 20.0進行統計分析，Duncan’s新復極差法對不同處理的差異性進行分析，Probit概率分析法計算IC。

2 結果與分析

2.1 坡柳種子精油得率

以料液比1∶10提取12 h，消耗坡柳種子3000 g，得精油質量2.88 g，計算得出坡柳種子精油提取率為0.096%。

2.2 坡柳種子精油對5種植物病原真菌的熏蒸抑菌活性

如表1所示，坡柳種子精油對5種供試植物病原真菌有不同程度的抑制作用，隨著精油濃度升高，對病原菌的抑制率也升高。當坡柳種子精油濃度為10μL/L時，對立枯絲核菌的活性最好，抑制率為60.50%，抑制率顯著高于對其他病原菌處理（＜0.05，下同）；對番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌的活性最差。當坡柳種子精油濃度為50μL/L時，對尖孢鐮刀菌的活性最好，抑制率為100.00%，抑制率顯著高于對其他病原菌處理；其次是對芒果炭疽病菌的活性，抑制率為87.10%；對番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的活性最差。

2.3 GC-MS分析結果

2.3.1 坡柳種子精油的總離子流圖采用GC-MS分析坡柳種子精油，通過數據處理系統，按面積歸一化法測得揮發油各組分含量。按照設定的GC-MS條件對坡柳種子精油進行分析，得坡柳種子精油總離子流圖（圖1）。

2.3.2 坡柳種子精油的主要化學成分GC-MS分析結果顯示，坡柳種子精油包含79種化合物（表2）。其中相對含量大于3.000%的有10種化合物，分別為苯甲醛（3.241%）、1-辛烯-3-醇（5.611%）、2-正戊基呋喃（5.896%）、-戊基丁內酯（5.820%）、亞油酸甲酯（5.507%）、1-己醇（5.328%）、2-丁基-2-辛烯醛（4.128%）、松柏烯（6.966%）、依蘭油烯（3.464%）和棕櫚酸甲酯（3.385%）。根據測試結果，參考市售的化合物種類，本研究選取1-辛烯-3醇、亞油酸甲酯、苯甲醛、-戊基丁內酯和2-正戊基呋喃等5種化合物進行抑菌活性測試。

2.4 5種化合物對5種植物病原真菌熏蒸抑菌活性

由表3可知，在處理濃度為50μL/L時，1-辛烯-3-醇和苯甲醛對5種植物病原真菌均表現出完全抑制；亞油酸甲酯對番茄灰霉病菌表現出活性，但對其余4種植物病原真菌無活性或活性差；-戊基丁內酯對立枯絲核菌、番茄灰霉病菌、尖孢鐮刀菌和番茄早疫病菌有不同程度的抑制活性，其中對尖孢鐮刀菌的活性最好，抑制率為58.9%，其次是對立枯絲核菌，抑制率為50.7%，而對芒果炭疽病菌無活性；2-正戊基呋喃僅對立枯絲核菌具有活性，抑制率為51.9%，對其余4種病原菌無抑制活性。

表1 坡柳種子精油對5種植物病原真菌菌絲的生長抑制率Table 1 Inhibition rate of essential oil of D.viscosa seed on mycelium of 5 plant pathogenic fungi

圖1 坡柳種子精油總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of essential oils of D.viscosa seed

2.5 2種化合物對5種植物病原真菌熏蒸抑菌活性的IC50

選擇對5種供試植物病原真菌抑制活性最好的2種化合物苯甲醛和1-辛烯-3-醇進行熏蒸毒力測定，結果（表4）顯示，2種化合物對5種植物病原真菌均有較好的抑菌活性。

3 討論

本研究采用同時蒸餾萃取法獲取坡柳種子精油，使用對扣熏蒸法測試了坡柳種子精油對5種植物病原真菌的抑制活性，結果表明坡柳種子精油對供試5種病原真菌具有不同程度的抑制活性。利用植物精油抑制植物病原真菌的研究較多，有研究報道珊瑚姜塊揮發精油（羅世瓊等，2013）、薰衣草精油（劉凡等，2017）和百里香精油（張阿強等，2017）對立枯絲核菌具有較好的抑菌活性。Chala等（2014）用玫瑰草（）和黑小茴香（）的揮發物測試對芒果炭疽病菌的抑菌活性，結果顯示對芒果炭疽病菌的生長抑制率為100%。本研究發現，坡柳種子精油在濃度為50μL/L時對立枯絲核菌和

芒果炭疽病菌的抑制率分別為81.10%和87.10%，雖然測定方法不同，但比較測定濃度的差異性，坡柳種子精油對立枯絲核菌和芒果炭疽病菌的抑制效果明顯，應給予高度關注。林霜霜等（2017）研究了檸檬香茅（）精油及其主要成分檸檬醛對番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌和辣椒尖孢鐮刀菌的抑制活性，結果表明，在200 mg/L濃度下檸檬香茅精油對3種病菌的抑制率分別為67.02%、32.03%

和20.42%。Zhao等（2021）研究發現，牛至（）精油對番茄灰霉病菌菌絲生長及孢子萌發有較好的抑制作用，當精油濃度為250 mg/L時對番茄灰霉病菌的抑制率可達96.39%，其成分中的香芹酚和百里香酚濃度為125 mg/L時對番茄灰霉病菌表現出完全抑制。本研究用50μL/L坡柳種子精油熏蒸尖孢鐮刀菌、番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌，抑菌率分別為100.00%、28.70%和28.60%。相比林霜霜等（2017）的結果，本研究使用的坡柳種子精油濃度更低，且對尖孢鐮刀菌的抑菌效果較好，對番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的抑菌效果較差；相比于Zhao等（2021）的結果，本研究所用濃度也偏低，若適當提高精油濃度，抑菌活性可能也會提升。

表2 坡柳種子精油GC-MS分析結果Table 2 GC-MS analysis results of the essential oil of D.viscosa seed

續表2坡柳種子精油GC-MS分析結果Continue Table 2 GC-MS analysis results of the essential oil of D.viscosa seed

表3 5種化合物純品對5種植物病原真菌的熏蒸抑制率（%）Table 3 Fumigation inhibition rates of 5 pure compounds against 5 plant pathogenic fungi（%）

表4 2種化合物純品對5種植物病原真菌的IC50（μL/L）Table 4 IC50 of 2 pure compounds against 5 plant pathogenic fungi（μL/L）

坡柳植物中化合物種類豐富，牛紅梅（2010）從地上部分（枝、葉和果實）的甲醇提取物中共分離鑒定得到12種化合物，包括2種新的二萜類化合物和2種新的異戊烯基黃酮類化合物，其中的2種新型二萜類化合物對致倦庫蚊（）4齡幼蟲顯示出毒殺活性。張來賓（2012）從其地上部分乙醇提取物的二氯甲烷部位共分離鑒定得到35種化合物，其中10種新的異戊烯基黃酮類化合物，7種新的二萜類化合物。本研究利用同時蒸餾萃取法獲取坡柳種子精油，并用GC-MS分析了其化學成分，共得到79種化合物。相比牛紅梅（2010）和張來賓（2012）的研究結果，坡柳種子精油化學成分種類更多。由于提取化合物的技術和溶劑不同，導致獲得的化合物種類不同（徐凱節等，2013；牛彪等，2019），若要明確坡柳植物中化合物的種類，還有待深入研究。

選取坡柳種子精油中的5種化合物苯甲醛、1-辛烯-3-醇、2-正戊基呋喃、亞油酸甲酯和-戊基丁內酯純品對5種植物病原真菌立枯絲核菌、番茄灰霉病菌、尖孢鐮刀菌、番茄早疫病菌和芒果炭疽病菌進行活性測定，結果顯示，苯甲醛和1-辛烯-3-醇在濃度為50μL/L時對5種供試植物病原真菌的抑制率為100.0%。1-辛烯-3-醇和苯甲醛作為食物香料和食物添加劑多通過化學途徑合成（張雷亮等，2017）。Herrera等（2015）研究發現，1-辛烯-3-醇能有效防治玉米象甲（）和黃萎病真菌（）。Lee等（2001）研究發現，苯甲醛對稻象甲（）有較好的熏蒸毒力。李雪玲和凌瑋瑋（2010）研究了桃仁中苯甲醛的提取及其抑菌作用，結果表明，在0.5 mol/L硫酸、80℃條件下水解80 min提取的天然苯甲醛對霉菌和細菌均有一定的抑制作用。此外，苯甲醛衍生物在生物活性方面多有利用，李曉榮（2012）報道苯甲醛希夫堿對革蘭氏陽性菌（G）的典型菌株金黃色葡萄球菌（）和革蘭氏陰性菌（G）的典型菌株肺炎克雷伯桿菌（）具有抑菌作用。1-辛烯-3-醇和苯甲醛可作為食品香料及食品添加劑使用，且2種化合物對立枯絲核菌、番茄灰霉病菌、尖孢鐮刀菌、芒果炭疽病菌和番茄早疫病菌具有較好的抑菌活性，結合其具有防腐性、芳香性的特點，表明1-辛烯-3-醇和苯甲醛在食品防腐研究及農業生產中植物病害防治上具有較好的應用前景。

4 結論

坡柳種子精油中化學成分種類豐富，其中1-辛烯-3醇和苯甲醛的活性最好。坡柳種子精油具有開發成為新型植物源殺菌劑的潛力。