松乳菇菌株的分離鑒定及其與馬尾松的互作效應

向健偉，龍芳，張立秋，周家春，鄭威，馬瓊*

（1湖北民族大學生物科學與技術學院，湖北恩施 445000；2恩施硒妹子葡萄釀酒有限公司，湖北恩施 445000；3湖北省農業科學院農業經濟技術研究所，湖北武漢 430063）

0 引言

【研究意義】松乳菇（，Ld）屬于紅菇科（）、乳菇屬（）真菌，俗稱樅樹菌，味道鮮美，營養豐富，含有豐富的松乳菇多糖，而松乳菇多糖作為一種活性成分，具有促進巨噬細胞增殖和腫瘤細胞凋亡的作用（錢葉等，2017）。松乳菇在湖北、江西、湖南、重慶、四川、貴州和云南等南方地區均有分布（林佳等，2016），主要發生在馬尾松林下，常與松屬植物的根系共生，是一種典型的珍稀外生菌根真菌，松乳菇子實體分化需要獨特的共生生態環境及營養條件（王冉等，2020）。由于生態環境的變化，我國南方地區野生松乳菇的分布和產量急劇下降，為保護野生乳菇屬真菌資源的多樣性，有必要進行松乳菇菌種資源的開發、馴化與共生栽培。【前人研究進展】國內外研究者模擬自然生態條件進行了松乳菇的馴化栽培。多數研究者認為，松乳菇與其松屬宿主植物間有促生作用，但松乳菇菌絲體均表現為不出菇或者出菇量低，不能真正實現規模化生產。周國英等（2003）開展松乳菇的菌種分離，獲得了松乳菇菌種。辜夕容等（2005）、馬瓊等（2005）、楊艷美（2011）在馬尾松（）根系外源接種松乳菇等外生菌根真菌，發現松乳菇等外生菌根真菌有利于培育馬尾松苗木。何躍軍等（2008）將松乳菇等外生菌根真菌接種柏木幼苗，證實了松乳菇對柏木幼苗促生效果較好。部分研究者認為松乳菇具有腐生性質，開展了松乳菇的腐生馴化栽培。方平夷（1994）利用棉籽殼和茅草等腐生栽培松乳菇，獲得了少量松乳菇原基；詹少華（2018）利用松針和雜樹葉腐生栽培松乳菇，成功實現了松乳菇栽培種菌絲體向菇蕾轉化。但腐生栽培均未能獲得成熟松乳菇子實體，有研究者開展了松乳菇與松屬植物的共生栽培。賀誼紅等（2016）在5年生馬尾松林中撒播松乳菇菌絲體，探究松乳菇的半人工馴化栽培，但出菇率不高。鄭華英等（2020）在松樹林下馴化栽培松乳菇，獲得了少量松乳菇子實體。目前，通過松乳菇與松屬植物根系形成菌根，將菌根苗在野外環境下培育，人工干擾子實體的形成，是獲得松乳菇的主要方法，該方法在新西蘭已經成功實施，但規模馴化栽培還未實現（Gollado et al.，2019）。松乳菇不能規模馴化栽培的主要原因在于，一是松乳菇菌株分離物不純，未進行分子鑒定，二是松乳菇特殊的共生生態條件無法滿足，未獲得高質量的菌根苗木，三是沒有形成子實體的足夠菌根化菌索及菌根。【本研究切入點】菌根化松乳菇菌索與菌根是影響馬尾松生長的重要生態因子（徐江等，2012），而外源接種外生菌根真菌能增加土壤肥力，促進共生植物的生長發育（陳躬國等，2020），目前有關松乳菇與馬尾松的互作效應鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】采用組織分離法分離湖北省恩施市境內野生松乳菇子實體，獲得菌絲分離物，基于rDNA ITS序列方法分子鑒定該菌絲分離物的種屬；分析外源接種松乳菇對馬尾松苗木的菌根侵染率、生長指標及氮（N）、磷（P）、鉀（K）元素含量的影響，對馬尾松菌根侵染率與松乳菇子實體生長指標的相關性進行分析，以期為建立松乳菇與馬尾松共生體系、實現松乳菇的規模馴化栽培打下基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌種的獲取與培養

試菜松乳菇子實體采自湖北恩施天然馬尾松次生林，林地馬尾松林齡主要為16～25年，海拔高度853～1065 m，壤土，郁閉度中等，年均降水量1400～1500 mm，年均氣溫14.9～16.3℃。用保鮮袋包裝松乳菇子實體樣本，帶回實驗室。在無菌條件下沖洗子實體表面，75%乙醇消毒，采用組織分離法獲得松乳菇菌種。使用打孔接種器，截取2塊直徑6 mm的菌塊，接種到新鮮制備的PDA固體培養基上，每菌接種3皿，25℃恒溫培養，培養5 d后記錄菌種的生長狀況，利用普通光學顯微鏡觀察菌絲的顯微特征。根據菌落培養特征得到3個菌株，即松乳菇恩施-1（Enshi 1，Ld-Es-1）、松乳菇恩施-2（Enshi 2，Ld-Es-2）和松乳菇恩施-3（Enshi 3，Ld-Es-3）。

1.2 菌種的分子鑒定

采用CTAB法提取3個菌株的菌絲基因組DNA，利用乳菇屬真菌rDNA ITS序列正向引物ITS1 5'-TC CGTAGGTGAACCTGCGG-3'和反向引物LDITS2R 5'-AGAGGAGCTGGGTCTAAG-3'（Guerin-Laguette et al.，2014），PCR擴增rDNA ITS序列，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化回收，引物合成及PCR產物測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。利用DANMEN 8.0拼接測序序列，將拼接后的核苷酸序列與NCBI nucleotide blast數據庫中已有的乳菇屬真菌rDNA ITS序列進行比對。

1.3 松乳菇栽培種菌絲體的制備

首先制備離體栽培種培養基，配方為馬尾松木屑14%、棉籽殼24%、稻草粉24%、玉米芯14%、干牛糞10%、珍珠巖10%、糖1.5%、石膏1.5%和磷酸二氫鉀1%，調節培養基水分含量至65%～70%、pH 7.2。將栽培種培養基質裝入500 mL玻璃錐形瓶，壓實，封瓶口，121℃高壓蒸汽滅菌2 h，待基質溫度降至室溫，每瓶培養基接入直徑6 mm的菌塊3塊，每菌株接種10瓶，置于25℃培養，記錄菌絲長勢、污染情況及菌絲長滿固體培養基質的天數，獲得栽培種菌絲體。

1.4 松乳菇與馬尾松共培養試驗

于2020年4月初，在標準苗床中進行松乳菇與馬尾松的共培養試驗。將苗床分隔成若干個1 m（1 m×1 m）小區，土壤消毒，塑料薄膜覆蓋7 d，分別接種3種栽培種菌絲體，接種量為400 g/m。將發芽的馬尾松種子播種至苗床中，播種量為40 g/m，苗期常規管理。試驗設接種無菌栽培種培養基對照（CK）和接種處理，均做3個重復。各接種處理如下：L-1處理，接種Ld-Es-1栽培種；L-2處理，接種Ld-Es-2栽培種；L-3處理，接種Ld-Es-3栽培種。在松乳菇與馬尾松幼苗共培養約6個月后，隨機抽取CK和接種處理的馬尾松幼苗，各抽取20株，用體式顯微鏡（徠卡M205FA）檢測馬尾松根系的菌根侵染率。在共培養11個月后，隨機抽取CK和接種處理馬尾松苗木，各抽取20株，測定馬尾松苗木的干重、株高、地徑、主根長、側根數及根系的菌根侵染率；截取CK和各接種處理馬尾松苗木的根系和葉片，分別烘干、粉碎，測定根系與葉片的N、P、K的含量，其中，N含量采用凱氏蒸餾法測定，P含量采用鉬銻抗比色法測定，K含量采用原子吸收分光光度法測定（張小燕，2013）。在共培養13個月后，觀察CK與接種處理馬尾松苗圃小區的出菇情況，統計各接種處理的出菇數量，計算平均出菇數、總鮮重、平均鮮重及松乳菇產量，其中：平均出菇數=同一接種處理出菇總數/重復小區數量；總鮮重為同一接種處理總鮮菇重量之和；平均鮮重=同一接種處理總鮮重/出菇數量；松乳菇產量=所有接種處理松乳菇總鮮重/接種處理小區總面積（1 m×9）。

1.5 統計分析

采用Excel 2013進行數據的錄入及整理；運用SPSS 22.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA），利用Duncan法進行多重比較分析。使用OriginPro 7.0制圖。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離培養特征

由表1可看出，接種5 d后3株菌絲分離物均能在PDA培養基上良好生長。其中，菌株Ld-Es-1的長勢強，培養5 d的平均菌落直徑為2.7～3.1 cm，約20.00 d長滿90 mm玻璃平板，老化菌絲分泌物為橘紅色；菌株Ld-Es-2培養5 d的平均菌落直徑為2.7～2.8 cm，約26.67 d長滿90 mm玻璃平板，老化菌絲分泌物呈淺綠色；菌株Ld-Es-3培養5 d的平均菌落直徑為2.4～2.5 cm，約32.00 d長滿90 mm玻璃平板，老化菌絲分泌物呈乳白色。各菌株長滿平板天數間差異顯著（＜0.05，下同），其中菌株Ld-Es-1生長天數最短。利用普通光學顯微鏡制片觀察3株真菌菌絲，菌絲均未見鎖狀聯合，有隔膜。

2.2 菌株的分子鑒定

3株菌株rDNA ITS序列的PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，均得到520～615 bp的DNA擴增產物（圖1）。將核苷酸序列在NCBI nucleotide blast數據庫中與已有的松乳菇ITS序列進行同源性分析，結果得出，菌株Ld-Es-1的ITS序列與云南松乳菇KY661914.1相似度為99.65%，菌株Ld-Es-2的ITS序列與四川松乳菇KX034408.1相似度為99.12%，菌株Ld-Es-3的ITS序列與云南松乳菇KY684167.1相似度為99.45%，序列相似度均大于99.00%，因此鑒定3株菌為松乳菇。

表1 3株菌的菌落培養及菌絲的顯微特征Table 1 Colony culture and microscopic characteristics of 3 strains

2.3 松乳菇栽培種的培養情況

玻璃錐形瓶因其瓶口小，內裝培養基質持水性好。采用玻璃錐形瓶制備3種松乳菇栽培種，3種受試菌株均能在錐形瓶制備培養基質中實現菌絲體的生長（圖2），菌絲體白色、粗壯、延伸生長良好。相比較而言，菌株Ld-Es-1菌絲生長最快，平均需要約22.60 d長滿固體基質，10瓶栽培種中僅1瓶出現霉菌污染；菌株Ld-Es-3生長良好，約30.80 d長滿基質，10瓶栽培種中有2瓶出現霉菌污染；菌株Ld-Es-2菌絲生長緩慢，菌絲長滿瓶的時間約為37.00 d，10瓶栽培種中有4瓶霉菌污染（表2）。各菌株長滿瓶固體基質所需時間差異顯著，菌株Ld-Es-1所需最短。

圖1 PCR擴增松乳菇菌株rDNA ITS序列Fig.1 PCR amplification of rDNA ITS sequence of L.deliciosus strains

圖2 松乳菇菌株在錐形瓶中的培養情況Fig.2 Cultivation of L.deliciosus strains in triangle flasks

2.4 接種松乳菇對馬尾松菌根侵染率和生長的影響

在松乳菇與馬尾松共培養約6個月后，由圖3可直觀看出，接種處理的馬尾松長勢遠好于CK。測定馬尾松幼苗根系的菌根侵染率，結果發現，3株供試菌株處理下馬尾松的菌根侵染率均在70.00%左右，馬尾松根系形成外生菌根，根尖表面布滿外生菌根真菌菌絲，而CK的馬尾松根系未發現菌根。

在松乳菇與馬尾松共培養11個月后，接種處理的馬尾松菌根侵染率均在95.00%以上，顯著高于CK，其中，L-1處理的馬尾松菌根侵染率高達98.36%，與L-3處理差異顯著（＜0.05，下同），與L-2處理差異不顯著（＞0.05，下同）（表3）。

由表3還可看出，在松乳菇與馬尾松共培養11個月后，接種處理表現出對馬尾松生長具有顯著促進作用，苗木的干重、株高、地徑、主根長和側根數均有所增加，各生長指標均與CK差異顯著。與CK相比，接種處理馬尾松干重增加5.41%～19.25%，株高增加11.15%～20.59%，主根長增加12.58%～28.90%，側根數增加34.88%～46.42%，地徑增加52.63%～68.42%，增幅最大。說明接種松乳菇能大幅度提高馬尾松苗木各生長指標，顯著改善苗木質量，其中，L-1處理的馬尾松干重、株高、地徑、主根長和側根數增幅最大，效果最優。

表2 松乳菇栽培種的培養特征Table 2 Cultural characteristics of L.deliciosus cultivar

圖3 松乳菇與馬尾松共培養后馬尾松長勢Fig.3 Growth of P.massoniana after co-cultivation of L.deliciosus strains with P.massoniana

表3 接種松乳菇對馬尾松生長及菌根侵染率的影響（n=20）Table 3 Effects of L.deliciosus inoculation on the growth and the mycorrhizal infection rate of P.massoniana（n=20）

2.5 接種松乳菇對馬尾松N、P、K含量的影響

N、P、K等大量營養元素含量是衡量植物養分狀態的一個重要指標，優良的外生菌根真菌與植物根系形成外生菌根，能活化土壤中的難溶性或難分解物質，從而促進共生植物吸收養分。由表4可知，在松乳菇與馬尾松共培養11個月后，L-1處理顯著提高了馬尾松根系和葉片的N和P含量，但K含量與CK差異不顯著。與CK相比，接種處理的根系N含量增加17.97%～44.04%，根系P含量增加13.03%～33.24%；接種處理的葉片N含量增加10.02%～45.17%，葉片P含量增加22.72%～49.84%；且馬尾松葉片的N和P含量均高于根系。由此表明，松乳菇接種處理不僅有利于根系吸收土壤中N、P元素，還能促進根系養分轉運到葉片。不同接種處理相比，各處理間馬尾松根系和葉片的N、P含量有差異，其中L-1處理根系和葉片的N、P含量均顯著高于L-3處理。

2.6 松乳菇子實體的形成及接種處理對子實體形成的影響

在松乳菇與馬尾松共培養約6個月后，3個供試菌株接種處理土壤中均有白色的菌絲體，而CK土壤中沒有肉眼可見的白色菌絲。在松乳菇與馬尾松共培養13個月后，松乳菇接種處理各重復均出菇，而CK沒有松乳菇出現，松乳菇子實體在馬尾松的莖基部生長，單生，從出菇至成熟需10 d左右，共獲得24個松乳菇子實體，平均出菇量為2.67個/m，產量為80.67 g/m，菇體的形態特征與其野生菌相似，進一步證實3種受試菌為松乳菇。分析3種受試菌子實體形成的差異，結果（表5）表明，L-1和L-3處理的子實體總鮮重稍高，L-2處理子實體總鮮重最低，L-1處理的總鮮重顯著高于L-2處理，但松乳菇平均出菇數和平均鮮重差異不顯著。

表4 接種松乳菇對馬尾松根系和葉片N、P、K含量的影響（mg/g）（n=20）Table 4 Effects of L.deliciosus inoculation on N，P and K contents in roots and leaves of P.massoniana（mg/g）（n=20）

表5 不同處理松乳菇子實體形成情況Table 5 Fruiting formation of L.deliciosus in different treatments

分析各接種處理松乳菇的平均出菇數、總鮮重、平均鮮重與馬尾松菌根侵染率的相關性，結果如表6所示，因接種處理各重復的出菇數差異較大，松乳菇平均出菇數、總鮮重與馬尾松菌根侵染率間的相關性不顯著。

3 討論

3.1 分子鑒定對松乳菇菌種的重要性及松乳菇的營養特征

傳統的真菌鑒定主要依據子實體的形態特征和菌種的培養特征，但乳菇屬多個種形態特征十分相似，基于子實體形態學特征鑒別野生菌根性食用菌易受到環境和個人主觀因素的影響，從該子實體分離獲得的菌種培養特征鑒定也不盡科學。隨著核酸分子鑒定技術的發展，rDNA ITS序列作為一種分子標記，已廣泛應用于真菌鑒定（郭亮等，2011；岳萬松等，2014），利用分子生物學技術結合形態學鑒定真菌，結果更準確更可靠。在本研究中，3株受試菌均能在PDA瓊脂培養基上良好生長，菌落培養特征不同，rDNA ITS序列分子鑒定結果表明均為松乳菇，其ITS序列與已有的松乳菇ITS序列相似度均大于99.00%。在脫離松屬植物環境條件下，利用松木屑、棉籽殼、稻草粉等木質素和纖維素含量高的原料作為離體培養松乳菇的基質，松乳菇菌絲體能實現良好生長，表明松乳菇屬于兼腐生外生菌根真菌，實現其馴化栽培具有可行性（陳玉華等，2013）。

3.2 松乳菇接種與馬尾松生長的關系

根際微生物對植物生長與養分吸收有重要作用，外生菌根真菌能增加根際土壤肥力，促進植物的生長發育，植株生物量、株高、地徑、主根長及側根數是評價苗木質量的重要指標（陳新等，2018）。外生菌根真菌侵染共生植物根系后，改變根系形態，增加植物根系的適應性，促進植物根系的生長，提高地徑和側根數，進而擴大根系吸收養分的面積（宋志強等，2020）。在松乳菇與馬尾松共培養11個月后，3株松乳菇均顯著提高了馬尾松的菌根侵染率，使馬尾松的菌根侵染率高達95.29%～98.36%。外源接種松乳菇大幅提高了馬尾松的生長指標，尤其是地徑和側根數增加幅度較大。松乳菇顯著提高了馬尾松對N、P養分的吸收，且N、P在馬尾松葉片中的含量分配比例高于根系，但對K養分的吸收影響不顯著，該結果與松乳菇對馬尾松的養分含量影響結果一致（辜夕容等，2005；楊艷美，2011）。總的來看，Ld-1處理無論對馬尾松苗木的菌根侵染率、生長及N、P養分吸收影響效果均優于Ld-3和Ld-2處理。

表6 馬尾松菌根侵染率與松乳菇子實體生長指標的相關分析Table 6 Correlation analysis of mycorrhizal ratio of P.massoniana with fruiting growth of L.deliciosus

3.3 共培養對松乳菇馴化栽培的影響

對于大多數菌根性食用菌而言，由于人工培養菌根苗木的外延菌絲難以形成菌索，無法分化形成子實體（馮萬艷等，2019）。在本研究中，松乳菇成功實現子實體分化，表明馬尾松菌根上的松乳菇外延菌絲能延伸生長，并與土壤相互交織形成菌索。但3個菌株與馬尾松共培養仍表現為松乳菇出菇周期長，出菇量低。本研究中松乳菇在共生培養13個月后出菇，出菇周期較短，松乳菇產量較低，僅80.67 g/m，低于新西蘭輻射松林共生栽培松乳菇的產量300 g/m（Guerin-Laguette et al，2014）。本研究中松乳菇的平均出菇數、總鮮重與馬尾松菌根侵染率間的相關性不顯著，原因與松乳菇外延菌絲生物量的積累不夠有密切聯系，外生菌根形成、菌索形成及子實體分化是一個連續的過程，土壤有機營養物質貧乏影響了松乳菇外延菌絲的生長及累積（羅佳煜等，2021），后期共生栽培需要以提高有機營養物質供給為出發點，或覆土增加小分子有機營養物質，亦或從分子水平上改造松乳菇分泌降解有機物質的酶（凡啟超，2016）。今后還需要進一步優化松乳菇出菇的營養條件和培養條件，建立更為成熟的松乳菇與馬尾松的共培養體系。

4 結論

rDNA ITS方法可準確鑒定野生松乳菇，外源接種松乳菇能促進馬尾松苗木的生長及對N、P等元素的利用，菌根侵染率的提高有利于松乳菇子實體形成，湖北省恩施市境內的松乳菇資源可作為馴化栽培松乳菇的潛在優良菌株。