軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤穿刺標本免疫組化H3F3B、IMP3、Clusterin 聯(lián)合H3F3B 基因突變檢測的意義

徐園園，毛榮軍，曾 敏，陳增偉，韓福蘭，吳燕杏，謝 樂，黃穎欣

（佛山市中醫(yī)院病理科，廣東 佛山 528000）

軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤（chondroblastoma-like osteosarcoma）與軟骨母細胞瘤（chondroblastoma）組織形態(tài)學具有相似性，兩者間的組織學鑒別要點在于軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤有腫瘤性骨樣組織區(qū)域，細胞異型性更明顯[1-3]。隨著骨腫瘤診治技術及水平的進步，骨腫瘤術前多行穿刺組織病理學活檢，穿刺組織的局限性以及骨腫瘤不同區(qū)域的異質(zhì)性均給骨腫瘤的病理學診斷帶來不小挑戰(zhàn)，當穿刺標本只有軟骨母細胞瘤樣區(qū)域且臨床及影像學特點均不明顯時，容易誤診為軟骨母細胞瘤[2-6]。目前尚未發(fā)現(xiàn)軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤有特異且高度敏感的免疫標記物或明確的基因改變，如何鑒別兩者仍有待研究。基于此，本研究擬通過免疫組織化學方法聯(lián)合檢測H3F3B、IMP3 及Clusterin 的表達情況，對其中H3F3B 陽性的軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤行H3F3B基因突變檢測，探討其在軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤和軟骨母細胞瘤穿刺標本診斷及鑒別診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集佛山市中醫(yī)院病理科2008 年1 月-2020 年12 月確診的軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤22 例、軟骨母細胞瘤25 例，所有標本均為術前穿刺標本及其對應的手術切除標本，所有病理組織學切片均由兩位高年資病理醫(yī)師復閱，與影像學及臨床三結(jié)合均診斷意見一致。

1.2 方法 所有標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，需要脫鈣處理的部分用溫和脫鈣液脫鈣，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，4～5 μm 連續(xù)切片，HE 染色，選取典型病變區(qū)域，采用SP 兩步法分別進行H3F3B（兔抗人組蛋白H3K36M 單克隆抗體，克隆號RM193，1∶100稀釋）、IMP3（胰島素樣生長因子II mRNA 結(jié)合蛋白3，即用型）及Clusterin（載脂蛋白J，兔單克隆抗體，克隆號EP181，即用型）免疫組織化學染色，所有抗體及試劑盒均購自上海杰浩生物技術有限公司。對免疫組化H3F3B 陽性的軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤標本行H3F3B 基因突變檢測。基因突變檢測交由上海生工生物工程公司進行Sanger 測序。

1.3 結(jié)果判斷 陽性部位：H3F3B：胞核；IMP3：胞質(zhì)；Clusterin：胞質(zhì)。陽性判定標準：＞90%中等以上強度著色為（+++），11%～90%中等以上強度著色為（++），1%～10%弱至中等強度著色為（+），＜1%著色為（-）。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點 22 例軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤患者中男15 例，女7 例，年齡14～29 歲，平均年齡21.32歲；影像學19 例均有骨質(zhì)破壞，其中6 例有軟組織腫塊并考慮惡性腫瘤，骨肉瘤與軟骨肉瘤鑒別；另外3 例傾向軟骨母細胞瘤。25 例軟骨母細胞瘤患者中男18 例，女7 例，年齡12～21 歲，平均年齡16.24歲；影像學可見膨脹性改變，未見軟組織腫塊，考慮軟骨母細胞瘤，所有病變均位于骨或骨關節(jié)。

2.2 免疫組化結(jié)果 手術切除標本中，軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤選取軟骨母細胞瘤樣區(qū)域（圖1）及腫瘤性骨樣組織區(qū)域（圖2）。免疫組化顯示，IMP3 在軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤中的軟骨母細胞瘤樣區(qū)域（圖3）及腫瘤性骨樣組織區(qū)域（圖4）均呈彌漫陽性，在軟骨母細胞瘤均呈陰性；H3F3B 在軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤中僅1 例的軟骨母細胞瘤樣區(qū)域（圖5）呈彌漫陽性，而在腫瘤性骨樣組織區(qū)域呈陰性；其余21 例軟骨母細胞瘤樣區(qū)域（圖6）及腫瘤性骨樣組織區(qū)域（圖7）均呈陰性或散在弱陽性。H3F3B 在25 例軟骨母細胞瘤均呈彌漫陽性（圖8）。Clusterin 在軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤兩種區(qū)域及軟骨母細胞瘤中均灶狀陽性或陰性，見表1。所有病例的多核巨細胞均不表達H3F3B、IMP3 及Clusterin。

表1 IMP3、H3F3B 及Clusterin 在軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤及軟骨母細胞瘤中的表達（n）

圖1 軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤的軟骨母細胞瘤樣區(qū)域（HE×200）

圖2 軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤的腫瘤性骨樣組織區(qū)域（HE×200）

圖3 IMP3 在軟骨母細胞瘤樣區(qū)域彌漫陽性（IHC×200）

圖4 IMP3 在腫瘤性骨樣組織區(qū)域彌漫陽性（IHC×200）

圖5 H3F3B 在軟骨母細胞瘤樣區(qū)域彌漫陽性（IHC×200）

圖6 H3F3B 在軟骨母細胞瘤樣區(qū)域散在弱陽性（IHC×200）

圖7 H3F3B 在腫瘤性骨樣組織區(qū)域散在弱陽性（IHC×200）

圖8 H3F3B 在軟骨母細胞瘤彌漫陽性（IHC×200）

2.3 基因突變檢測結(jié)果 5 例軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤免疫組化H3F3B 有強弱不等的陽性，行H3F3B 基因突變檢測，均為陰性。

3 討論

軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤是普通型骨肉瘤的一種亞型，其發(fā)生部位、年齡、影像學特征符合骨肉瘤的特點，組織形態(tài)學具有軟骨母細胞瘤的部分特征，但其部分區(qū)域可觀察到腫瘤性骨樣組織，并有髓內(nèi)浸潤、骨皮質(zhì)侵蝕及軟組織腫塊的特點，可與軟骨母細胞瘤鑒別。部分病例臨床及影像學特點均不典型，即使在大標本中有時也很難找到典型的腫瘤性骨樣組織區(qū)域，術前穿刺組織病理學活檢常常只能觀察到軟骨母細胞瘤樣區(qū)域，容易誤診為軟骨母細胞瘤[7-9]。

軟骨母細胞瘤的治療方法以病灶切除為主；軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤是惡性腫瘤，治療方法以手術切除及術前術后化療為主。骨肉瘤以往單純手術切除的5 年生存率在10%～20%，而臨床可切除的骨肉瘤聯(lián)合術前術后化療的5 年生存率＞50%，化療可以明顯改善患者的預后，接受了術前化療且有良好效應的患者有可能實行保肢手術。骨肉瘤誤診或者漏診，可導致患者失去接受系統(tǒng)治療的機會，生存率大大降低。

既往的研究發(fā)現(xiàn)，IMP3 在胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、涎腺粘液表皮樣癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、骨肉瘤、黑色素瘤、間皮瘤、前列腺癌等多種惡性腫瘤組織中有表達[10-13]，與腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移密切相關，可通過上調(diào)IGF-II 蛋白的表達水平導致腫瘤細胞增生，通過調(diào)節(jié)多種細胞黏附因子使腫瘤細胞黏附，形成樹突狀偽足，產(chǎn)生侵襲作用[14-16]。本組實驗中，IMP3 在22 例軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤兩種區(qū)域均彌漫陽性，在25 例軟骨母細胞瘤均陰性，IMP3 彌漫陽性支持軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤的診斷。

人組蛋白H3.3 的變體包括H3F3A（定位于1q42.12）及H3F3B（定位于17q25.1）兩個編碼基因，表達于細胞周期任何階段，在活性基因啟動子區(qū)、增強子區(qū)和內(nèi)部調(diào)節(jié)區(qū)等取代H3.1/H3.2[17]，通過表觀調(diào)節(jié)影響基因的表達，主要參與細胞增殖、分化、減數(shù)分裂等多個生物學過程[18]。既往文獻報道H3F3B是軟骨母細胞瘤敏感且特異的診斷標記物[19]，在軟骨肉瘤中陰性表達[20]；約90%的軟骨母細胞瘤具有H3F3B 基因突變，尚未發(fā)現(xiàn)骨肉瘤具有特殊的基因改變。本研究22 例軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤中，18 例的H3F3B 均陰性，3 例散在弱陽性，僅1 例的軟骨母細胞瘤樣區(qū)域彌漫強陽性，但在腫瘤性骨樣組織區(qū)域陰性，提示腫瘤不同區(qū)域存在異質(zhì)性，容易誤診；而這些有陽性區(qū)域的病例未檢測出H3F3B 基因突變，提示免疫組化與基因檢測缺乏一致性。22 例中有3 例的影像學傾向軟骨母細胞瘤的診斷，穿刺標本中有5 例僅見軟骨母細胞瘤樣區(qū)域，給診斷帶來更大難度。

Clusterin 是一種存在于多種細胞組分中具有多種存在形式、功能復雜多樣的蛋白，參與細胞內(nèi)外重要的生命活動，與神經(jīng)退行性疾病、免疫疾病、衰老、腫瘤等在內(nèi)的許多疾病相關[21]。本研究顯示，Clusterin 在軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤及軟骨母細胞瘤中均呈灶狀陽性或陰性，診斷應用價值不大。

綜上所述，軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤及軟骨母細胞瘤組織形態(tài)學上有相似性，穿刺標本中不易區(qū)分，對不典型的病例，單憑形態(tài)學診斷容易誤診，聯(lián)合檢測免疫組化IMP3 及H3F3B 對明確診斷有較大指導意義。在結(jié)合臨床、影像及病理形態(tài)學特點的基礎上，H3F3B 陰性、IMP3 彌漫陽性支持軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤的診斷，H3F3B 彌漫陽性、IMP3 陰性支持軟骨母細胞瘤的診斷，H3F3B 陽性、IMP3 彌漫陽性更傾向于軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤的診斷，即使在未檢見腫瘤性骨樣組織的穿刺標本，H3F3B 陰性、IMP3 彌漫陽性時仍高度傾向軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤的診斷，需結(jié)合臨床及影像學，避免誤診漏診。另外，病理診斷中需充分取材，尋找有無腫瘤性成骨，并結(jié)合臨床及影像學鑒別軟骨母細胞瘤與軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤。