基于生物信息學方法分析HMMR在結直腸癌中的表達及臨床意義

周洪晨，劉洪濤，張成，汪穎厚

（錦州醫科大學北部戰區總醫院研究生培養基地，遼寧 沈陽 110015）

結直腸癌（CRC）是一種發生于結腸或直腸血腦屏障的異質性疾病［1］。盡管幾年前CRC 的發病率相對較低，但最近的發病率和死亡率不斷上升［2］。到目前為止，盡管有眾多結直腸癌早期篩查的方法，其中又以結腸鏡的敏感性和特異性最佳，但結腸鏡是一種侵入性質的檢查，使其難以廣泛應用于早期檢查［3］。因此CRC 的早期診斷依舊是一個全球性的問題［4］。我們迫切需要一種低成本、無創的方法，包括對早期診斷有價值的新型生物標志物。研究表明，結直腸癌發生率受到營養狀態的強烈影響，不健康的高脂肪/高碳水化合物的飲食顯著促進了CRC 病例［5］的增加。結直腸癌的發生通常是一個漫長和復雜的過程，包括從正常上皮細胞惡性轉化成為癌細胞的幾個步驟，涉及到大量的基因變化，導致各種表型改變［6］。其中大量因子參與了這個過程［7］。而有研究表明，透明質酸介導的運動受體（hyaluronan mediated motility rcecptor,HMMR）基因在許多癌癥的病理中起著重要作用。其中HMMR 蛋白在乳腺腫瘤細胞破壞周圍基質中發揮著一定作用［8］。此外，有報道稱HMMR 已被證實與肺癌患者總生存率降低有關［9］。

腫瘤的發生發展是由細胞和細胞外基質及其他細胞的相互作用完成的。而透明質酸是細胞外基質（ECM）的主要組成成分，其在細胞基本行為中發揮了重要的作用。HMMR 也稱為CD168，在最初的時候被認為是一種新型透明質酸受體［10］。HMMR 與透明質酸、鈣調蛋白、肌動蛋白以及細胞外調節激酶信號通路成分之間相互作用，在細胞遷移及粘附等過程中起到了重要的作用。并在透明質酸、TGF-β 或PDGF 的作用下，HMMR 可激活多種信號級聯［11］。此外，HMMR 可以調控MEK1 和ERK1/2，從而保持有絲分裂紡錘體的完整性、調節細胞周期的進展以及控制細胞外基質（ECM）重組和降解的基因的表達。在許多腫瘤中，HMMR 的過表達均被證實與疾病進展有關。但關于HMMR 與CRC 的關系，及其分子機制的研究尚報道較少。因此，本文旨在通過生物信息分析以及免疫組化驗證等方式進一步研究HMMR 與CRC 發生發展及預后的關系。

在本研究中，我們從以Oncomine 數據庫為主的多個數據庫中提取了HMMR 在結直腸癌組織及癌旁組織的表達情況。并通過Oncomine 數據庫提供的臨床信息，分析了HMMR 表達與CRC 臨床病理特征及生存預后之間的關系。此外還利用了GO富集分析、String 蛋白互作網絡、KEGG 通路分析等研究與HMMR 調控機制可能有關的通路。以期證明HMMR 是一個與CRC 診斷及預后有關的標志物。

1 資料與方法

1.1 差異基因篩選及數據處理

先通過TCGA 數據庫下載基因數集，再采用“edgeR 包”對上述基因表達矩陣進行轉換與分析［以P＜0.05、logFC（fold change）＞4 或logFC＜-4］為篩選條件，從而得到結直腸癌中差異基因集（見圖1），并制作火山圖。并從中篩選出差異基因HMMR。

圖1 結直腸癌中差異基因表達圖

1.2 生物信息學資料

1.2.1 HMMR 在結直腸癌與正常結直腸組織中的差異 使用 Oncomine 數據庫（https://www.oncomine.org/）檢索條件：①Cancer Type:Colorectal cancer；②Gene: HMMR；③Analysis Type: Cancer vs.Normal Analysis；④臨界值設定條件（P value＜1E-4,fold change＞2），分析結直腸癌組織與正常組織的基因差異表達并篩選出目的基因HMMR；證明HMMR 在結直腸癌中顯著高表達。利用BioGPS 數據庫（http://biogps.org/#goto=welcome）檢索條件，檢索條件：Gene:HMMR，分析目的基因HMMR 在正常人體各種組織及細胞中的表達情況。使用HPA 數據庫（The Human Protein Atlas）檢索條件，檢索條件：Gene:HMMR，下載HMMR 在結直腸癌及正常結直腸組織中的免疫組化染色圖片。

1.2.2 臨床病理資料分析 使用Ualcan 數據庫（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）檢索條件：Gene: HMMR,Cancer Type: Colorectal cancer，分析HMMR 的表達與臨床病理資料的相關性。

1.2.3 患者生存預后分析 使用GEPIA 數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）檢索條件：Gene:HMMR,Log2 FC≥1,P＜0.01,Cancer Type: Colorectal cancer 以及COX 分析目的基因HMMR 在結直腸癌及正常組織中的表達情況以及HMMR 的表達對結直腸癌患者生存預后的影響。

1.2.4 蛋白互作網絡圖、GO 富集分析及KEGG通路分析 使用String 數據庫（https://string-db.org/）檢索條件：Protein Name: HMMR，制作PPI蛋白互作網絡圖。使用Linkedomics 數據庫（http://www.linkedomics.org/）檢索條件，檢索條件：Gene: HMMR。以及使用DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）檢索條件，檢索條件：Gene:HMMR。進行GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析。

1.2.5 免疫浸潤及亞型分析 使用TISIDB 數據庫（http://cis.hku.hk/TISIDB）檢索條件，檢索條件：①"Cancer: Colorectal cancer"；②"Gene: HMMR"，用于分析HMMR 在CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、巨噬細胞等免疫浸潤細胞中的表達以及HMMR 在結直腸癌的不同分子亞型和免疫亞型表達的差異。

2 結果

2.1 HMMR mRNA 在不同腫瘤類型中的表達情況

HMMR 表達差異具有統計學意義的共有72項，其中HMMR 高表達的研究64 項，HMMR 在結直腸癌中高表達的研究有9 項（見圖2），研究中低表達的有8 項。在肺癌、乳腺癌等大部分腫瘤中HMMR 呈現為高表達；而在血液系統腫瘤中呈現為低表達（見圖3）。

圖2 HMMR 在結直腸癌中表達情況

圖3 HMMR mRNA 在不同腫瘤中的表達情況

Oncomine 數據庫檢索顯示，在涉及的9 個關于HMMR 與結直腸癌關系的研究中（見圖4），此類研究分別發表于Mol Cancer Res，PLoS One，TCGA Colorectal。與正常組對比，HMMR mRNA 在所有差異基因中其中位數值排名為325.0，差異有統計學意義，差異有統計學意義（P＜0.01），提示HMMR 在結直腸癌中顯著高表達。

圖4 HMMR 在結直腸癌各個研究中的結果分析

2.2 HMMR mRNA 在結直腸癌和正常結直腸組織中的不同表達情況

通過GEPIA 數據庫分析后顯示，與正常組織相比，HMMR 在結直腸癌組織中表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 HMMR 在結直腸癌和正常結直腸組織中的不同表達情況

2.3 HMMR mRNA 在結直腸癌、正常結直腸組織、T 細胞以及B 細胞中的表達分布

BioGPS 數據庫分析后顯示，HMMR 在結直腸癌中高表達，在正常結直腸組織、T 細胞和B 細胞中均是低表達，見圖6。

圖6 HMMR 在正常人體組織和細胞中的表達圖

2.4 HPA 數據庫免疫組化結果

先通過從HPA 數據庫下載HMMR 在結直腸癌及正常組織的免疫組化染色圖片。得出結果，結直腸癌組織中HMMR 染色成陽性（見圖7A)，配對癌旁組織中HMMR 表達呈陰性（見圖7B）。

圖7 HMMR 在結直腸癌及正常組織的免疫組化染色圖

2.5 HMMR 與結直腸癌臨床病理特征相關性分析

通過Ualcan 數據庫進行HMMR 基因表達與臨床病理資料相關性分析，納入286 例腫瘤樣本、41 例正常組織樣本。分析結果顯示在stage分期、性別、淋巴結轉移等亞組中，HMMR 在結直腸癌中的表達均顯著高于正常組織，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖8A-F。其中在結腸癌中不同stage 分期、淋巴結轉移中組間差異有統計學意義（P＜0.01）見圖8A、8E。而在直腸癌中不同性別中存在組間差異有統計學意義（P＜0.01），見圖8D。

圖8 HMMR 基因表達與臨床病理資料相關性分析圖

2.6 高表達HMMR mRNA 的結直腸癌患者的OS、RFS 評估

通過GEPIA 數據庫OS/RFS 結果顯示，HMMR mRNA 高表達組結直腸癌患者的OS 較低表達組顯著延長（=0.55,P＜0.01）；HMMR mRNA 高表達組結直腸癌患者的RFS 較低表達組，差異無統計學意義（=0.84,P＞0.05）（見圖9、圖10）。

圖9 HMMR 的表達和結直腸癌患者總生存期的關系

圖10 HMMR 的表達和結直腸癌患者無進展生存期的關系

圖10 HMMR 的表達和結直腸癌患者無進展生存期的關系

2.7 HMMR 基因是結直腸癌患者OS 的良好預后因子

Cox 分析顯示HMMR 基因是結直腸癌患者OS的良好預后因子，其中為0.436，95%CI為0.254～0.746,P=0.002，差異具有統計學意義。此外，遠處轉移、淋巴結轉移、浸潤深度是結直腸癌患者OS 的危險因素。見表1。

表1 影響結直腸癌患者OS 的單因素分析

2.8 String 數據庫分析HMMR 相互關聯的基因并行蛋白互作網絡

利用String 數據庫尋找HMMR 相互關聯基因18 組，并構建HMMR 相關蛋白互作網絡圖（見圖11）。其中HMMR 與經典癌癥指標CD44 具有關聯性。

圖11 HMMR 相互關聯蛋白互作網絡圖

2.9 Linkedomics 數據庫及DAVID 數據庫進行GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析

先通過Linkedomics 數據庫中篩出與HMMR共表達基因有PTTG1/CDC25C/NCAPG/CENPE 等538 種，再根據正相關、負相關分組并繪制火山圖（見圖12）。再通過DAVID 數據庫分別進行GO 及KEGG 分析。主要涉及的KEGG 信號通路包括細胞周期信號通路、P53 相關信號通路、卵母細胞減數分裂信號通路；細胞組分主要集中在細胞中心體、微管細胞骨架、紡錘體、細胞溶質、細胞核等10 類；分子功能有蛋白激酶結合、微管結合、組蛋白激酶活性、蛋白綁定等5 類；生物學過程有有絲分裂核分裂、細胞分裂、有絲分裂紡錘體組裝以及有絲分裂G2/M 轉變等11 類過程，見表2。

圖12 HMMR 共表達基因

表2 HMMR 和相關基因的GO 功能注釋和KEGG 通路富集

2.10 HMMR mRNA 在結直腸癌組織中與多種免疫細胞的關系

通過TISIDB 數據庫研究發現，HMMR mRNA與NK 細胞、B 細胞、巨噬細胞、CD4+T 細胞和肥大細胞等細胞在結直腸癌組織的免疫微環境中的表達明顯相關，差異有統計學意義（P＜0.01）；而與中性粒細胞、CD8+T 細胞在結直腸癌組織免疫微環境中的表達無確切關系，差異無統計學意義（P＞0.05）（見圖13）。其中HMMR mRNA 表達水平與CD4+T、Th2 細胞呈正相關；而與其余免疫細胞呈負相關（見圖14）。

圖13 HMMR 與各個腫瘤免疫細胞間的相關性

續圖13 HMMR 與各個腫瘤免疫細胞間的相關性

圖14 HMMR 在結直腸癌中與腫瘤免疫細胞間的相關性

2.11 HMMR 在結直腸癌的不同分子亞型和免疫亞型表達的差異。

在結直腸癌的分子亞型中，HMMR 在超突變單核苷酸受體（HM-SNV）表達最高，在基因組穩定性（GS）中表達最低（見圖15）（P＜0.01）。在結直腸癌的免疫分型中，HMMR 在IFN-γ 為主型表達最高，在炎癥性表達最低（見圖16）（P＜0.01）。

圖15 HMMR 在結直腸癌的不同分子亞型中的表達

圖16 HMMR 在結直腸癌的不同免疫亞型中的表達

3 討論

細胞周期的調節在腫瘤的發生發展過程中起到了重要作用。正常細胞的分裂分為G0、G1、S、G2以及M 五個階段，而在癌細胞的分裂過程中常伴有絲分裂相關因子以及蛋白的表達異常。在有絲分裂過程中，著絲點準確地附著在染色體上，以保證其準確的分離。有絲分裂紡錘體的形成與細胞分裂、染色體的分離起到了關鍵性的作用［12］。HMMR 的表達受細胞周期調節，主要在G2晚期以及有絲分裂早期之間的峰值表達。HMMR 定位于紡錘體極，通過與微管的結合，進而使得紡錘體高度穩定，并通過激活紡錘體調控位點，進而在整個細胞周期過程中維持了紡錘體的完整性及穩定性。在GUO 等［13］報道，HMMR 的高表達與組織分級、病理分期和生存狀態顯著相關，HMMR在肝癌中表達為高水平。HMMR 的高表達可能是肝癌的不利預測因素。LI 等［14］研究表明HMMR在肺腺癌組織中處于高水平，同時，HMMR 可能促進了肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。YE 等［15］報道，未分化多形性肉瘤（UPS）中含有大量細胞外基質（ECM），包括透明質酸（HA）。而透明質酸介導的HA 受體（HMMR）的表達在正常組織中呈現低表達，而在UPS 中表達上調。此外，HMMR 的高表達與較差的臨床結局相關。通常來說，HMMR 在大多數正常組織中呈低表達，但在一些增生性組織如脾臟、睪丸、胎盤和胸腺中表達升高［16］。另一些癌癥中，低表達的HMMR 往往提示預后較差。例如，超過一半的惡性周圍神經鞘腫瘤中HMMR 表達下調［17］；HMMR 表達在絕大多數的精原細胞瘤中降低［18］。上述研究表明HMMR 基因在不同類型腫瘤中可能發揮著不同的作用。

目前關于HMMR 在結直腸癌中的具體作用機制研究尚存爭議。因此，本研究旨在通過生物信息學深入分析HMMR 基因，并探索HMMR 在結直腸癌與正常組織中的不同表達及與免疫細胞浸潤、預后的關系。本研究發現，HMMR 在大部分腫瘤中呈高表達，表達增高的研究64 項，表達降低的研究8 項，HMMR 在結直腸癌中高表達的研究有9 項。在其他癌中，在肺癌、乳腺癌、肝癌等HMMR 呈現為高表達；而在血液系統腫瘤中呈現為低表達。這一結果與他人研究相一致。通過GEPIA 數據庫分析發現，HMMR 基因的表達水平對結直腸癌患者的OS 存在顯著影響，HMMR mRNA 高表達組結直腸癌患者的OS 顯著延長，表明HMMR 高表達的結直腸癌患者預后可能會更好。繼續通過Linkedomics 數據庫挖掘到與HMMR共表達基因，并對其進行功能注釋和KEGG 通路富集分析，發現主要涉及的KEGG 信號通路包括有細胞周期信號通路、P53 相關信號通路；功能注釋主要涉及微管結合、有絲分裂紡錘體組裝以及有絲分裂G2/M 轉變等。HMMR 在有絲分裂早期與紡錘體的微管特異性結合，使得紡錘體高度穩定，加強了細胞周期G2/M 期檢測點對腫瘤細胞的監控，進而促使結直腸腫瘤細胞凋亡并抑制其增殖。通過TISIDB 數據庫發現，HMMR 與NK 細胞、B細胞、巨噬細胞、CD4+T 細胞和肥大細胞等細胞在結直腸癌組織的免疫微環境中的表達明顯相關。推測是HMMR 參與了多種免疫細胞的免疫防御功能，減少了腫瘤細胞對免疫細胞的抑制作用，提高了結直腸癌患者機體防御力［19-20］，從而延長結直腸癌患者總體生存期。通過Ualcan 數據庫發現，在結直腸癌的不同Stage 分期中，HMMR 在Ⅰ期的表達顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期；在結直腸癌的不同淋巴結轉移中，HMMR 在N0 組的表達顯著高于N1、N2 組。這也同樣證實了，HMMR 促使了結直腸腫瘤細胞凋亡并抑制其增殖。

綜上所述，我們通過對結直腸癌組織中HMMR 相關基因信息的深入挖掘，進一步證明了HMMR 在CRC 患者中確實為高表達，且與結直腸癌的預后及免疫細胞浸潤密切相關。今后可能作為CRC 患者潛在的分子標志物。相較于傳統單一實驗樣本的研究，腫瘤數據庫具有樣本量大、可信度高等優點，對疾病的診治與分析提供了強有力的生物學依據，也為進一步探索HMMR 基因與結直腸癌的關系奠定了基礎。