生姜中姜酚類化合物的制備工藝研究

董文南，柴堯，鄭洋濱，劉劍

1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.南京麗來醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 南京 210023

姜為姜科多年生草本植物姜（Zingiber officinaleRosc.）的根莖，為藥食兩用的安全性較高的一味中藥，使用歷史悠久，藥理作用確切，用途十分廣泛。中醫(yī)認(rèn)為，生姜具有解表散寒、溫中止嘔、化痰止咳等功效［1］。《本草綱目》中記載：生姜?dú)馕稖匦粒夥コ魵猓ㄉ衩鳎?jīng)五臟除風(fēng)邪寒熱，傷寒頭痛鼻塞，咳逆上氣，止咳吐，去痰下氣［2］。科學(xué)研究表明生姜發(fā)揮的藥效作用與姜酚的存在有關(guān)，姜酚的種類有很多，其中6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚含量較多［3-4］。臨床前研究表明，這種天然物質(zhì)可能作為各種形式的癌癥的補(bǔ)充治療手段,包括結(jié)腸癌、肺癌、肝癌和乳腺癌等［5-7］，姜酚類化合物可以作為重要的先導(dǎo)分子，用于開發(fā)治療藥物，治療各種危及生命的癌癥［8-9］。姜酚的化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，易氧化變質(zhì)，易見光受熱分解，且在生姜中含量較低，不易分離［10］。姜酚為脂溶性成分，不同的提取條件對姜酚的提取效率有較大影響［11］。因此，姜酚的提取分離、純化鑒定以及其化學(xué)合成或結(jié)構(gòu)改造等［12-13］工作，備受國內(nèi)外科研工作者的重視。目前國內(nèi)對生姜中的6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚提取方法尚未確定，系統(tǒng)性比較尚不全面，本試驗(yàn)以生姜中6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚為指標(biāo)，運(yùn)用溶劑提取法和樹脂進(jìn)行純化，最大限度地提取出生姜中的6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚，為后期將生姜開發(fā)成各種形式的癌癥補(bǔ)充治療產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ME204TE 型電子天平；MS205DU 型電子天平；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋；N-1100D-WD 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；ZQPZ-228 型低溫振蕩器；LC-20ADXR 型高效液相色譜。

1.2 材料

生姜（產(chǎn)地：南昌）購于超市，經(jīng)江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院的萬林春副教授鑒定為姜科植物姜（Zingiber officinaleRosc.）的新鮮根莖。6-姜辣素對照品（Sigma 公司，批號：SLCG1228）；D-101、AB-8、HPD-950、SP70、SP207、XAD7HP 大孔吸附樹脂、聚酰胺樹脂（江西省東方化玻設(shè)備有限公司）。正丁醇、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜酚的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：OSAKA SODA CAPCELL PAKC18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，45% A；10～15 min，45% →48% A；15～17 min，48% →60% A；17～43 min，60% A；43～45 min，60% →67% A；45～48 min，67% →69% A；48～58 min，69%→71% A）；檢測波長：282 nm；流速：0.5 mL/min ；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：15 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱定適量6-姜辣素對照品，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為87 μg/mL 的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 投料藥材含量：取生姜切成1～2 mm 的小塊，取約1 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

藥液含量：精密量取藥液適量，置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 姜酚的測定方法 依據(jù)《中國藥典》（2020 年版）生姜含量測定項(xiàng)下規(guī)定，通過檢測并計(jì)算6-姜辣素含量；以6-姜辣素為對照，利用校正因子分別計(jì)算8-姜酚（校正因子：0.770 8）和10-姜酚（校正因子：0.782 3）的含量。6-姜辣素對照品和生姜樣品溶液中的6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖：A.6-姜辣素對照品溶液；B.生姜樣品溶液

2.2 姜酚提取工藝優(yōu)選

75%乙醇提取次數(shù)單因素試驗(yàn)結(jié)果表明回流提取2 次，6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的相對提取率均大于85%，故選擇回流法提取2 次進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)選。以姜酚相對提取率為考察指標(biāo)［（6-姜辣素相對提取率+8-姜酚相對提取率+10-姜酚相對提取率）/3，有效成分相對提取率=藥液中含量/投料藥材含量×100%］，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、加醇量及提取時(shí)間為考察因素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，每個(gè)因素選擇3 個(gè)水平。準(zhǔn)確稱取生姜20.0 g，攪碎，共9 份，選用L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)安排及直觀分析結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 生姜提取工藝正交試驗(yàn)安排及直觀分析

表2 生姜提取工藝方差分析表

由直觀分析可知，各因素對生姜姜酚提取工藝的影響順序?yàn)锳＞B＞C。方差分析結(jié)果表明因素A 具有顯著性影響，其中k3＞k2＞k1，故選擇A3，其他因素則均無顯著性影響，其中因素B 中k3 ≈k2＞k1，綜合乙醇成本考慮，故選擇B2；其中因素C 各水平差異較小，綜合時(shí)間成本考慮，故選擇C2；綜上，最佳工藝組合A3B2C2，即分別加10倍和5 倍量75%乙醇提取2 次，每次1.0 h。稱取生姜100 g，攪碎，平行3 份，按最佳工藝進(jìn)行提取，結(jié)果姜酚的相對提取率分別為93.6%，91.5%，92.0%，平均值92.4%，RSD 為1.18%。表明優(yōu)化后工藝合理、穩(wěn)定、可行。

2.3 姜酚樹脂純化工藝優(yōu)選

2.3.1 上樣液制備 稱取生姜500 g，攪碎，按照最佳工藝提取，減壓回收乙醇至無醇味，加水稀釋成每毫升0.5 g 生藥的藥液，備用。

2.3.2 樹脂型號選擇 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的大孔樹脂各5.0 g，分別置50 mL 錐形瓶中，各精密加入上樣液20 mL，于室溫振搖（120 r/min）16 h 至吸附平衡，上層液濾過，按照“2.1”進(jìn)行檢測。濾渣再精密加入75%乙醇100 mL，后續(xù)步驟同上，解析液按照“2.1”進(jìn)行檢測。計(jì)算姜酚靜態(tài)收率（靜態(tài)吸附率×靜態(tài)解吸率），結(jié)果見表3。由表可知，XAD7HP 型大孔吸附樹脂的靜態(tài)收率為98.7%，明顯優(yōu)于其他型號樹脂。

表3 不同型號樹脂靜態(tài)吸附洗脫 %

2.3.3 動(dòng)態(tài)吸附考察 量取預(yù)處理好的XAD7HP 型大孔吸附樹脂20 mL，濕法裝柱，量取上樣液300 mL，緩慢上樣，控制流速，以2～3 BV/h 的體積流量通過樹脂層，分份收集上樣流出液（20 mL/份），每份按照“2.1”進(jìn)行檢測。以累計(jì)流出液體積為橫坐標(biāo)，泄漏率為縱坐標(biāo)，繪制泄漏曲線，結(jié)果見圖2，當(dāng)上樣液體積超過200 mL 時(shí)，姜酚開始泄露。因此，確定最大上樣量為每5 g 生藥用濕樹脂1 mL。

圖2 姜酚泄露曲線

2.3.4 動(dòng)態(tài)解吸曲線 量取預(yù)處理好的XAD7HP 型大孔吸附樹脂20 mL，濕法裝柱，精密量取上樣液200 mL，以2～3 BV/h 的體積流量緩慢上樣，上樣結(jié)束后，依次用水、40%、60%、80%乙醇溶液4 BV進(jìn)行洗脫，控制洗脫流速2～3 BV/h，洗脫液分份收集（2 BV/份），每份按照“2.1”進(jìn)行檢測，計(jì)算姜酚洗脫收率，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%時(shí)，姜酚開始被洗脫出來，綜合經(jīng)濟(jì)成本，選擇75%乙醇作為洗脫溶劑，水和40%乙醇作為除雜溶劑。

圖3 洗脫醇濃度的考察

2.3.5 洗脫體積考察 量取預(yù)處理好的XAD7HP 型大孔吸附樹脂20 mL，濕法裝柱，精密量取上樣液200 mL，以2～3 BV/h 的體積流量緩慢上樣，上樣結(jié)束后，依次用水、40%乙醇溶液4 BV 進(jìn)行除雜，控制流速2～3 BV/h，除雜液棄去。再用75%乙醇8 BV 進(jìn)行洗脫，分別按0～4 BV，4～6 BV，6～8 BV單獨(dú)收集，結(jié)果見圖4。

圖4 沖洗柱體積對姜酚洗脫收率的影響

由圖可見，75%乙醇達(dá)到6 BV 時(shí)，姜酚全部洗脫完畢，因此確定75%乙醇用量為6 BV。

2.4 姜酚溶劑萃取純化工藝優(yōu)選

2.4.1 萃取水相制備 稱取生姜200 g，攪碎，按照確定工藝提取、純化，將75%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，加水稀釋至1 g/mL。

2.4.2 萃取工藝優(yōu)選 分別取萃取水相各50 mL，共4份，置150 mL 萃取瓶中，分別精密加入正丁醇、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷各50 mL，振搖10 min，靜置60 min，分取澄清有機(jī)相，再分別精密加入對應(yīng)溶劑25 mL，振搖10 min，靜置60 min，分取澄清有機(jī)相，合并，減壓回收溶劑至干，加水分散，凍干，按照“2.1”進(jìn)行檢測，計(jì)算萃取率及純度，結(jié)果見表4。由表可知，選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑，萃取率及純度均高于其他溶劑。

表4 萃取溶劑考察 %

2.5 工藝驗(yàn)證

稱取生姜100 g，攪碎，平行3 份，按上述最佳工藝條件進(jìn)行提取、純化，結(jié)果姜酚的總相對轉(zhuǎn)移率分別為70.2%，73.7%，71.3%，平均值為71.7%，RSD 為2.50%；純度分別為66.3%、63.2%、65.9%，平均值為65.1%，RSD 為2.59%。表明優(yōu)化后工藝合理、穩(wěn)定、可行。

3 討論

大量研究證實(shí)生姜中的姜酚具有抗腫瘤作用，且作用機(jī)制多種多樣，能夠?yàn)椴煌愋偷陌┌Y提供更廣泛的預(yù)防和治療選擇［14］，因此姜酚的分離純化工作顯得尤為重要。目前，生姜總姜酚的提取方式大部分僅僅還限制于溶劑提取方面，純化方面尤其是柱層析方面的工作開展較少。本試驗(yàn)以總姜酚作為衡量指標(biāo)，溶劑提取法與柱層析分離相結(jié)合，彌補(bǔ)溶劑法得率低的問題，提高總姜酚純度，用于后期姜酚抗腫瘤體外試驗(yàn)［15］。進(jìn)一步優(yōu)化生姜總姜酚的提取工藝條件、最佳純化工藝，再通過乙酸乙酯萃取的方法極大地提高了總姜酚的純度。確定的提取純化工藝經(jīng)濟(jì)合理穩(wěn)定可行，姜酚純度可達(dá)到65.1%。