中藥中黃曲霉毒素檢測與脫毒技術研究進展

王燕，劉緒平，章紅，段和祥，劉衛德，霍曉菲

1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）為一組化學結構類似的真菌次級代謝產物，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）毒性最強、污染普遍，被列為Ⅰ級致癌物。研究表明，AFT 具有嚴重的肝毒性，甚至產生致畸、致癌和致突變等危害［1］。然而，中藥在種植、采收、炮制加工、貯藏等各個環節都有可能出現AFT 污染，影響中藥質量和臨床用藥安全［2］。近年來，中藥的質量安全特別是中藥中AFT 污染問題已經嚴重制約了我國中藥現代化發展進程。因此，中藥中AFT 檢測及降解脫毒技術的研究迫在眉睫。本文在簡要介紹中藥中AFT 污染狀況基礎上，對AFT 國內外限量標準、AFT 檢測技術及降解脫毒技術進行了歸納總結，以期為解決AFT 污染問題，保障中藥質量提供思路。

1 黃曲霉毒素的污染與限量

中藥污染AFT 與其自身基質和外部環境之間有著密切的關系。污染的方式復雜多樣，可能發生在整個鏈條上，從鮮品到最終產品。從內部因素來看，某些中藥基質為霉菌生長代謝提供充足營養，從而加劇AFT 污染程度，如脂肪油、糖類、蛋白質等基質成分。其中脂肪油含量高的中藥最易受AFT 污染，其次則是富含糖類和蛋白質的中藥［3］。然而富含揮發油的藥材被證實具有抑制霉菌生長的作用，與其他中藥材混合儲存，可以提高其他中藥的防霉能力，為中藥防霉技術提供了新思路。從外部因素來看，光照、溫度、水活度、營養物質、pH 值、氧化脅迫等環境因子都會對AFT 的合成產生影響［4］。

近年來，隨著人們對AFT 的不斷深入研究，為維護公眾健康，保障用藥安全，各國對中藥中AFT進行了限量規定（表1）。

表1 各國藥典對中藥中的黃曲霉毒素限量標準 μg/kg

2 黃曲霉毒素檢測技術

目前，儀器分析法和免疫學分析法是常用的AFT 檢測技術。儀器分析法包含高效液相色譜法、液質聯用法和表面增強拉曼散射法等，免疫學分析法有酶聯免疫吸附法、膠體金免疫層析技術和熒光免疫法等。然而，儀器分析法的樣品前處理繁瑣，儀器成本昂貴，且需要專業技術人員操作，難以滿足即時檢測要求；免疫分析法耗時耗財，且操作過程難以自動化。近年來，隨著科技的不斷創新和發展，膠體金免疫層析法、免疫芯片、免疫傳感器等大批新檢測技術層出不窮，這些新技術極大彌補了傳統技術在即時檢測和現場可視化等方面的短板，為中藥中AFT 現場快速可視化等檢測技術提供了有力支持。

2.1 薄層色譜法

薄層色譜法（TLC）是一種傳統的化學分析方法，為最早應用于測定AFT 的經典方法之一。其原理是基于AFT 在紫外燈照射下具有熒光性，從而進行定性定量分析。此技術操作簡便，成本低廉，但其前處理復雜，特異性差，靈敏度低，檢測耗時，不能滿足當下檢測分析要求。

2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）具有較高的檢測分離多種真菌毒素效能，成為檢測AFT 常用的方法之一。該技術原理是采用色譜柱分離技術，根據待測物分離的不同實際情況，通過測量色譜峰面積進行AFT 定量分析［6］。HPLC 法有多種衍生化方法，如柱前衍生、柱后光化學衍生及柱后碘衍生等。其中，柱后光化學衍生法的應用較為廣泛。由于其不需添加衍生化試劑，可通過在線紫外線照射將無熒光性的AFB1和AFG1羥基化，使其具有熒光性，提高靈敏度，且不影響其他組分，進而可通過熒光檢測器同時檢測4 種AFT 成分。例如，王云霞等［7］采用HPLC-柱后光化學衍生法檢測清火片（膠囊）中黃曲霉素G2、G1、B2、B1。該衍生化法還廣泛應用于眾多的動植物藥材中，如蓮子、柏子仁等［8-9］。HPLC-柱后碘衍生法在檢測中藥材中AFT 也有應用，如陳皮、三七粉等［10-11］。

2.3 液相色譜-質譜聯用技術

液質聯用技術（LC-MS）將液相色譜與質譜有效結合，實現優勢互補［12］，能快速、準確地定性定量分析藥材中痕量的AFT。羅朝權等［13］建立了一種即時檢測動物類藥材污染AFB1和AFG1的液質聯用法，應用該法檢測分析發現，土鱉蟲等動物類藥材受到黃曲霉菌嚴重污染。此外，隨著技術的不斷改進，研究者們從凈化方式和聯用儀器等方面入手，提出了更多優化方案，如劉震營等［14］采用IAC-HPLC-ESI-MS/MS 法測定柏子仁中的AFT。

2.4 免疫檢測技術

免疫檢測技術是抗原與抗體高度特異性識別的檢測方法［15］，綠色無污染，在AFT 檢測領域應用廣泛。以下歸納總結了中藥常用的AFT 免疫檢測技術。

2.4.1 酶聯免疫吸附法 酶聯免疫吸附法（ELISA）應用抗原抗體的特異性反應和酶的高度專一性、高效催化作用，進而測定AFT 含量。該法可批量即時檢測樣本中的AFT，但在實際檢測中，很容易受到重金屬離子、脂肪及pH 等因素的干擾，可能會出現假陰/陽性結果，樣品中的氧化酶、蛋白酶自身具有不穩定性，試劑保質期短，這也可能會對檢測結果造成影響。劉蕊等［16］建立間接競爭ELISA 法快速檢測酸棗仁、柏子仁等6 味中藥材的AFs，并采用HPLC 法進行結果確證，兩者的檢測結果一致，可用于快速檢測AFs。

2.4.2 膠體金免疫層析技術 膠體金免疫層析技術（GICT）是一種固相膜免疫分析方法，它將膠體金免疫技術與色譜層析技術相結合，具有靈敏度高、特異性強等特點，結果判斷直觀可靠，無需大型儀器設備和專業技術人員，適用于抽樣現場快速篩查［17］。但GICT 制備抗體成本昂貴，樣品提取效率較低，檢測結果重復性差，易出現假陽性結果，需要進一步優化。李細芬等［18］采用GICT 檢測酸棗仁等6 味中藥材中AFB1含量，其結果與ELISA 法測定結果一致，所檢測中藥飲片中AFB1含量均符合要求。

2.4.3 熒光免疫分析法 熒光免疫分析（FIA）結合了高靈敏度的熒光技術和高特異性的免疫學反應。其原理是利用待測物在反應體系中特定結合位點的熒光強度，通過定性或定量分析獲得檢測結果。根據熒光標記材料的不同，可分為時間分辨熒光免疫分析法、熒光偏振免疫分析法和熒光激發共振能量轉移免疫分析法等［19］。該技術易實現高通量、自動化檢測，但抗體成本昂貴，儀器不便攜，不適合現場篩查。余宇燕等［20］建立了一種快速靈敏的直接競爭FIA 用于檢測陳皮、胖大海等5 味中藥中AFB1含量。結果表明，AFB1-FITC 標記抗體的結合比率為4.19，可用于中藥中AFB1的分析測定。

2.4.4 化學發光免疫法 化學發光免疫法（CLIA）采用化學發光試劑標記抗原或抗體，根據化學發光檢測儀檢測待測物的信號強弱來確定其含量。根據標記物的不同，可分為化學發光免疫分析法、化學發光酶免疫分析法和電化學發光免疫分析法。該技術無輻射、靈敏度高、線性范圍寬、方法快速穩定、自動化程度高，標記物有效期長且穩定性好，但成本相對昂貴。吳震等［21］利用生物素親和及抗原與抗體免疫反應，建立了一種基于光激化學發光均相免疫檢測技術的AFB1檢測方法。

2.4.5 免疫傳感器 免疫傳感器由生物識別元件和信號轉換元件組成，結合了免疫檢測技術和生物傳感器技術。根據傳導信號的不同，可分為光學免疫傳感器、電化學免疫傳感器和壓電晶體免疫傳感器等［22］。該技術是一種具有廣泛發展前景的新型檢測技術，其自動化程度高，不受樣品顏色、濁度的影響，可同時檢測多種真菌毒素［23］。Wu 等［24］采用以T7 核酸外切酶、脫氧核糖核酸為模板的銀納米簇，建立了用于檢測AFB1的銀納米簇熒光生物傳感器，該方法檢測限可達0.89 pg/mL。

2.4.6 免疫芯片 免疫芯片是生命科學與微電子學等學科交叉發展而形成的新興前沿技術。基本技術環節包括芯片微陣列制備、樣品制備、生物分子反應和信號的檢測與分析。根據其探針的不同，可分為基因芯片和蛋白芯片。該技術可進行多參數同步分析，但其還處于開發初期，點樣器成本昂貴，且樣品極易發生交叉反應，因此免疫芯片的應用范圍受限，還需深入研究［25］。

2.5 表面增強拉曼散射技術

表面增強拉曼散射（SERS）法是一種新型的快速檢測技術，其原理是樣品吸附在貴金屬粗糙表面時，拉曼光譜信號受表面等離子共振而增強。在對樣品進行分析時，具有樣品非接觸、不破壞的特點［26］，同時可增強拉曼信號來實現檢測極限的提高。該技術分辨率高、快速無損、設備攜帶方便，廣泛應用于生物醫藥［27］、食品安全［28］等諸多領域。然而，具有較強SERS 效應的貴金屬種類極少，很難制備出重現性好、靈敏度高的基底，并且貴金屬增加了檢測成本，難以商業化。基于免疫法的SERS 傳感器可以在芯片上獨立檢測3 種真菌毒素［29］。在納米溶膠由濕態向干態轉化的過程中進行實時SERS采集的技術稱為動態SERS（D-SERS），相較于常規SERS 信號，增加了2～3 個數量級。基于此，任菲等［30］采用D-SERS 對薏苡仁中的AFG1進行檢測。該方法采用擦拭法提取樣品表面的AFG1，以AuNP作為SERS 的增強基底進行D-SERS 分析，其檢測限達到5.5 μg/kg。

3 黃曲霉毒素降解脫毒技術

目前，降解AFT 常用的脫毒技術有物理法、化學法和生物技術法。

3.1 物理法

物理降解脫毒技術是利用光、熱、輻射等方式破壞AFT 的毒性，主要有高溫加熱法、吸附法、輻射法和溶劑萃取法等。

3.1.1 高溫加熱法 高溫加熱可破壞大部分毒素，但AFT 的降解溫度高（280 ℃左右），并且高溫加熱同時也可能會破壞中藥材基質結構，如蛋白質、氨基酸等。因此高溫降解AFT 實際操作過程中存在較大困難，且能源消耗大，一般不宜采用。

3.1.2 吸附劑吸附法 吸附劑一般有活性炭、蒙脫石、沸石粉等。Martinez 等［31］研究表明活性炭能夠有效吸附赭曲霉素和AFT，真菌濃度在所有實驗對象中均下降。此法可吸附大部分毒素，成本低廉，但目前沒有最高效的吸附劑，有待進一步研究。

3.1.3 輻射法 常用的輻射有γ 射線、紫外線、紅外線、電子束等。其中，γ 射線照射和紫外線技術的降毒效果顯著［32］。Nurtjahja 等［33］研究表明，肉豆蔻中黃曲霉菌種群總數及菌株活力隨 γ 輻射劑量增加而下降。此外，Patras 等［34］研究發現，紫外線照射可顯著降低純水中的AFT（P＜0.05），并且增加紫外線劑量可降低細胞中AFT 引起的細胞毒性。但輻照耗能高，會對操作人員帶來潛在身體傷害，因此實際應用中受阻。

3.1.4 溶劑萃取法 萃取溶劑有乙醇、乙腈-水、水溶性丙酮等溶液。陳建茹等［35］研究對比了75%乙醇與水對柏子仁中AFT 的脫毒效果，結果表明，75%乙醇更佳，但仍無法達到完全脫毒，且脫毒后的樣品可能仍不符合法定限量標準。該法既無副產物產生，也不會破壞蛋白質結構，但要求精確的樣品和溶劑的比例，萃取溶劑成本高且廢液處理繁瑣，因此在一定程度上限制了其應用。

3.2 化學法

化學法是指采用化學試劑處理與生物毒素發生化學反應，破壞其化學結構，從而降低或消除其毒性。傳統化學試劑雖然能有效降解AFT，但同時可能存在化學殘留會污染環境或影響藥材化學成分。

3.2.1 堿處理法 羅小榮等［36］研究表明，1%碳酸氫銨溶液+2%～5%氨水清洗蓮子，AFT 下降趨勢明顯，去除率可達90%以上。此法操作難度低，成本低廉，是一種適合于工業化大生產的清洗方法。

3.2.2 氧化處理法 氧化劑通過氧化分解AFB1末端的呋喃環，從而降低毒性，常用的氧化試劑有ClO2、H2O2、O3、Cl2等。Yu 等［37］研究發現，ClO2氣體可以抑制黃曲霉菌菌絲生長、孢子萌發和產生AFB1。AFB1的降解率隨著ClO2濃度的增加而提高，而且AFB1的降解速度明顯加快。但該法同樣面臨化學殘留問題而限制了其應用。

3.2.3 天然精油法 天然精油可有效抑制黃曲霉菌生長和其毒素合成［38］。李紅玲，高微微［39］將揮發油直接混合于種子中、涂于表面、填充于包裝中，發現一定劑量的何首烏揮發油具有抑菌效果。天然精油提取自中藥，綠色無污染，且能夠充分利用藥材有效成分。這為藥對養護提供了新思路，將易霉變中藥與富含抗菌抑菌成分的藥材按照合理的比例混合貯藏，在一定程度上可以避免藥材霉變。但揮發油含量較低，成分復雜，使用難度大，成本昂貴。

3.3 生物法

生物脫毒法主要是利用微生物或其代謝產物進行脫毒，具有效率高、特異性強、綠色無污染的優勢，且處理條件相對溫和，不會破壞藥材品質，因此成為最近研究熱點之一。目前已經發現細菌、真菌及酵母菌等都具有降解AFT 能力［40］，該法包括生物酶解法、生物吸附法等［41］。

3.3.1 生物酶解法 生物酶解法是利用專一性和高效性的某些酶分解毒素分子的功能性基團，將AFT 降解為低毒或無毒化合物。目前，酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌等微生物已經被證實對黃曲霉菌具有顯著的抑制效果［42］。黃曲霉毒素解毒酶和葡萄糖氧化酶等酶制劑也逐漸被用于AFT 的脫毒［41］。

3.3.2 生物吸附法 生物吸附法是利用微生物與AFT結合，形成菌體-AFT 復合體，達到脫毒目的。研究發現，酵母菌、乳酸菌和雙歧桿菌可通過細胞壁吸附作用去除AFT，其吸附能力與細胞壁結構有關［43］。該法綠色環保，但吸附過程低效且可逆，并不能從本質上脫去毒性，因此高效可行的生物吸附劑有待進一步研究。

4 結語

中藥中AFT 污染問題成為制約中藥國際化的關鍵因素之一。國內在這一領域的研究從未停止過，但AFT 含量超標事件仍經常發生。因此，中藥中AFT 檢測及脫毒技術將成為當前及今后的一個研究熱點。目前應用的AFT 檢測技術中，儀器分析法具有靈敏度高、檢測結果精確的優點，但仍有待解決的問題，如：樣本前處理復雜、對儀器及專業技術人員要求高、難以滿足即時檢測等；免疫學檢測方法具有靈敏度高、特異性強、方便快捷的特點，適用于現場快速檢測。在未來研究中，開發出更靈敏、更快速、更經濟的檢測技術成為新的趨勢和挑戰。在AFT 降解脫毒技術研究領域，與傳統的物理或化學降解方法相比，生物降解技術去除AFT 具有安全、高效、環保、無毒無害等優點，是未來研究AFT 防治的發展方向。因此，只有確保現有中藥中AFT 檢測和解毒技術與時俱進，才能保障用藥安全有效，推動中藥現代化、國際化進程。