十味參蛇洗劑微生物限度檢查方法的建立及驗證

潘磊，肖麗麗

1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2.江西省皮膚病專科醫院，江西省皮膚病臨床醫學研究中心，國家皮膚與免疫疾病臨床醫學研究中心，江西省皮膚病研究所，南昌大學附屬皮膚病醫院，江西 南昌 330001

十味參蛇洗劑為江西省皮膚病專科醫院的醫院外用制劑，處方由苦參、蛇床子、地膚子、黃柏、金銀花、連翹、百部、烏梢蛇、蜂房、千里光等十味藥材組成。具有清熱除濕，祛風止癢，解毒殺蟲的作用。其中處方中大部分藥材中含有抑菌成分［1-8］，如君藥苦參中的苦參總堿、苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿等成分對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌及白色念珠菌均具有一定程度的抑制效果［1］。此外中藥制劑處方中的飲片大多來源于植物及動物等，極易受到微生物的污染，是中藥制劑微生物污染的重要來源之一。本文根據《中國藥典》2015 版四部通則［9］中關于微生物檢查的規定和方法，對十味參蛇洗劑的微生物限度檢查方法進行研究，并對建立的方法進行了驗證，確保該醫院制劑的微生物限度檢查方法符合規定，能有效地反映該制劑中所含微生物的真實情況，確保用藥安全。

1 儀器與材料

1.1 儀器設備

BT125D 電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；LMQ.C-50E 立式滅菌器，山東新華醫療器械股份有限公司；ZW-2008 智能集菌儀，琪摩（上海）電子科技有限公司；SJ-CJ-1D 超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；BHC-1300 ⅡA2生物安全柜，阿爾泰實驗設備有限公司；PYXDHS-55-40 細菌培養箱，上海躍進醫療器械一廠；MJ-250BSH-Ⅱ霉菌培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］，批號：9a2-2；枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］，批號：2a27-2；白色念珠菌［CMCC（F）98001］，批號：2a21-2；銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］，批號：2a28-2；黑曲霉［CMCC（F）98003］，批號：0A1004；以上菌種皆購自中國食品藥品檢定研究院。各試驗菌株均為第三代工作菌。

1.3 培養基與稀釋液

沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號：20190808）；胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號：20190907）；甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號：20190322）；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號：20190228）；以上培養基均由北京奧博星生物技術有限責任公司生產。胰酪大豆胨液體培養基（批號：190708，上海博微生物科技有限公司）；0.9%無菌氯化鈉溶液（自制，氯化鈉，批號：190911，西隴科學股份有限公司）。

1.4 供試品

十味參蛇洗劑（批號：200901、200902、200903，規格：每1 mL 相當于飲片0.425 g），均由江西省皮膚病專科醫院提供。

2 實驗方法

2.1 試驗用菌液的制備

根據2015 版《中國藥典》四部通則1105及1006 要求，將各試驗菌制成菌懸液，濃度在50～100 cfu/mL 左右。

2.2 供試品的制備

十味參蛇洗劑為水溶性液體制劑，按規定可使用原液作為供試品。另取10 mL 供試品，用稀釋液（0.9%無菌氯化鈉溶液）稀釋制成1∶10 供試液；

2.3 微生物限度檢查方法研究

2.3.1 預實驗 根據2015 版《中國藥典》四部1105要求，選擇對培養環境要求較高的枯草芽孢桿菌進行需氧菌檢查，同時選擇生長曲線較快進入穩定期的白色念珠菌［10］進行霉菌和酵母菌計數檢查，進行預實驗。預實驗結果見表1。

表1 預實驗結果

預實驗結果顯示采用平皿法時十味參蛇洗劑會抑制枯草芽孢桿菌的生長，而對白色念珠菌抑制效果不明顯。當以薄膜過濾法（原液、1∶10 供試液）檢查需氧菌總數，沖洗量為300 mL 時，枯草芽孢桿菌的回收比值均為0.3，不在規定的范圍內。沖洗量為500 mL 時，原液和1∶10 供試液回收比值均為0.9，所以進行需氧菌總數檢查時采用薄膜過濾法（原液、1∶10 供試液，500 mL 沖洗，每次100 mL）；進行霉菌及酵母菌總數檢查時采用平皿法（原液、1∶10 供試液）。

2.3.2 需氧菌總數計數試驗 分別取供試品原液及1∶10 供試液各1 mL，按照薄膜過濾法，用500 mL稀釋液（0.9%無菌氯化鈉溶液）進行沖洗，將100 cfu 左右的試驗菌加入最后進行沖洗的稀釋液中，待水分濾干后，取出濾膜，立即貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上，在30 ℃～35 ℃進行1 d～3 d 的培養，每日進行觀察。以稀釋液替代菌液，按相同方法制備供試品對照組樣品。另用稀釋液替代供試液，按相同方法制備菌液對照樣品。重復3 次上述試驗。具體結果如表2 所示。表2 結果表明使用薄膜過濾法（原液、1∶10供試液，500 mL 沖洗，每次100 mL）進行需氧菌總數計數檢測，所有試驗菌的回收率都在藥典要求的0.5～2.0 的范圍內。

表2 需氧菌總數計數試驗結果（n=3）

2.3.3 霉菌和酵母菌總數計數 分別取供試品原液及1∶10 供試液各9.9 mL，加入0.1 mL 適宜濃度的試驗菌，使得每1 mL 供試液中試驗菌含量不超過100 cfu，混勻。將1 mL 供試液注入平皿中，然后立即將適量的沙氏葡萄糖瓊脂培養基倒入平皿；在20 ℃～25 ℃培養箱中進行1 d～5 d 的培養，每日進行觀察。以稀釋液替代菌液，按相同方法制備供試品對照組樣品。另以稀釋液替代供試液，按同樣方法制備菌液對照組樣品。重復3 次上述試驗。結果如表3 所示。

表3 霉菌和酵母菌總數計數試驗結果（n=3）

表3 結果顯示白色念珠菌和黑曲霉的菌數回收比值均在藥典規定范圍內，所以可以使用平皿法進行霉菌和酵母菌總數計數檢查。

2.3.4 控制菌檢查 十味參蛇洗劑為皮膚給藥制劑，根據《中國藥典》2015 版四部中規定以銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌作為試驗菌進行控制菌檢查的研究。

按照藥典規定的金黃色葡萄球菌檢查方法操作，制備供試品樣品，按要求進行培養觀察。同時以稀釋液替代供試液，按相同的方法操作，制備陰性對照樣品，以消除稀釋液及培養基的干擾。觀察其菌落的生長情況。試驗結果見表4。

按照藥典規定的銅綠假單胞菌檢查方法操作，制備供試品樣品，并按要求進行培養觀察。同時以稀釋液替代供試液，按相同的方法操作，制備陰性對照樣品，以消除稀釋液及培養基的干擾。觀察其菌落的生長情況。試驗結果見表5。

表5 銅綠假單胞菌檢查結果

根據表4、5 的結果可以看出，十味參蛇洗劑對金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞菌的抑菌效果不顯著，控制菌檢查可采用常規方法進行。

2.4 三批樣品的微生物限度檢查

為驗證所建的微生物限度檢查方法的是否適用，對三個不同批次的十味參蛇洗劑進行微生物限度檢查，結果顯示建立的微生物限度檢查方法適用于十味參蛇洗劑。結果見表6。

表6 三批樣品微生物限度檢查結果

3 討論

供試品原液及1∶10 供試液采用薄膜過濾法檢測需氧菌計數總數時，菌數回收比值均在規定范圍內，但由于十味參蛇洗劑中有輕搖易散的沉淀，供試品原液過濾時，速度緩慢，且在薄膜上保留顏色較深，在觀察菌落生長情況時存在一定的干擾，故在最終確定十味參蛇洗劑需氧菌計數總數檢測方法中選用1∶10 供試液采用薄膜過濾法進行檢測。使用平皿法（原液）進行霉菌和酵母菌總數進行檢測，控制菌檢查方法為常規法。此外本研究建立的微生物限度檢查方法同樣適用于2020 版《中國藥典》的相關規定［11］。