銀耳多糖的抗光老化作用初探

于玲

（福建省輕工業研究所有限公司，福建 福州 350005）

皮膚是人體最大的器官，有著保護、調節、感覺等功能，但其長期暴露在具有各種危險因素，如紫外線（UV）、化學物等[1,2]的環境中。UV的照射可導致皮膚產生一系列毒性效應，包括紅斑、水腫、脫屑、皮膚炎癥、光老化以及光致癌[3-5]，這與活性氧簇（ROS）、氧化應激及DNA、脂質、蛋白等氧化損傷相關。UVB（波長280～320 nm）可造成細胞DNA損傷，生成嘧啶二聚體損傷表皮細胞，是人類皮膚癌的主要致癌物[6,7]，因此，為減緩皮膚光老化尋找合適的抗光老化產品日益受到重視。

近期，多種自然化合物正作為抗氧化劑備受關注。銀耳是一種藥食兼用真菌，含有豐富的多糖、維生素、蛋白質和礦物質等營養物質[8,9]。銀耳多糖（Tremella fuciformis polysaccharides，TFPS）是銀耳中最主要的功效活性成分，具有補水保濕、抗氧化、美容麗膚等功效[8]，銀耳多糖（TFPS）在調節UVB誘導的皮膚表皮損傷的作用仍有待研究。本文探索了銀耳多糖（TFPS）對UVB照射后人永生化角質形成細胞（HaCaT細胞）的抗光老化作用，旨在為銀耳多糖（TFPS）在具有抗光老化活性的功能護膚品或修復皮膚光損傷治療藥物方面的應用提供經驗和數據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑：銀耳多糖（福建省輕工業研究所中間試驗工廠）；HaCaT細胞（廣州艾迪基因科技有限責任公司）；CCK-8試劑盒、0.4%臺盼藍染液（碧云天生物）。

儀器與設備：紫外交聯儀（UV07-II，南京寧凱儀器有限公司）；倒置顯微鏡（CKX53，Olympus公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養以及UV照射

采用完全培養基（含10%體積分數的胎牛血清以及終濃度為1 μmol/L 青霉素、鏈霉素DMEM培養基），將處于生長指數期的HaCaT細胞接種在不同規格的培養皿中貼壁培養，培養箱溫度37 ℃，二氧化碳濃度5%。

用緩沖溶液PBS（濃度 0.01 mol/L，pH值為7.4）清洗培養細胞。UVB（280～320 nm）輻照強度控制為0.60 mW/cm2、照射距離20 cm，輻照計測定距離為UVB燈管20 cm處，根據公式⑴確定輻照時間。

1.2.2 細胞活力測定

不同濃度TFPS對HaCaT細胞活力的影響：將細胞接種在96孔板中（1×104細胞/孔），每組設置3個重復孔，在 37 ℃、5%二氧化碳濃度的條件下培養12 h，待細胞貼壁后，使用含相應終濃度為0、1、2、3、4、5 mg/mL的TFPS的完全培養基培養48 h后，根據 CCK-8試劑盒的說明書，向每孔加入110μL CCK工作溶液（100μL PBS+10μL CCK溶液），靜置培養箱內，孵育45 min，使用酶標儀測定在波長450 nm處的吸光度，根據公式⑵計算細胞活力。

不同濃度銀耳多糖（TFPS）對 UVB照射后HaCaT細胞活力的影響：細胞分為0、5、10、20、30 mJ組，將細胞接種在96孔板中（1×104細胞/孔），在37 ℃、5%二氧化碳濃度的條件下培養48 h，移除培養基后每孔加入100μL的PBS，用相應劑量UVB照射，然后使用含終濃度5 mg/mL的TFPS的完全培養基培養24 h，同法進行CCK-8檢測，計算細胞活力。根據實驗結果選擇特定UVB劑量，照射同法培養的HaCaT細胞，使用終濃度分別為0、1、2、3、4、5 mg/mL的TFPS的完全培養基培養24 h，同法計算細胞活力。

將細胞接種在六孔板中（3×105細胞/孔），在37 ℃、5%二氧化碳濃度的條件下培養48 h，移除培養基，用PBS清洗3遍，每孔加入200μl的PBS后接受UVB照射。使用含相應終濃度TFPS（0、1、2、3、4、5 mg/mL）的完全培養基培養24 h，去除培養基，用PBS清洗3遍，加入0.04%臺盼藍工作液（PBS∶0.4%臺盼藍=9∶1），每孔300μL，于倒置顯微鏡下觀察細胞著色情況，計數并進行數據分析。

1.2.3 統計分析使用Image J、PowerPoint、Graphpad Prism 5.0、Photoshop和Excel軟件進行數據處理、分析以及制圖。所有實驗結果以平均值±標準差表示，顯著性差異使用單因素方差分析（one-way ANOVA 和ttest分析），P<0.05認為具有統計學差異。

2 結果與討論

2.1 不同濃度TFPS對HaCaT細胞活力的影響

CCK-8 實驗結果表明，不同濃度TFPS對HaCaT細胞均無毒害作用，且可促進細胞增殖（P<0.05）（圖1），因此，選擇5 mg/mL濃度進行后續實驗。

圖1 不同濃度TFPS對HaCaT細胞活力的影響

2.2 TFPS 對HaCaT細胞受不同劑量UVB照射后的細胞活力影響

HaCaT 細胞在接受5、10、20、30 mJ/cm2的UVB照射后，細胞活力均明顯下降，細胞固縮，實驗組細胞經5 mg/mL的TFPS處理后，除30 mJ/cm2劑量照射組外，細胞活力較對照組均明顯增加（P<0.05）（圖2）；臺盼藍染色結果顯示實驗組陽性細胞數較空白組明顯減少（p<0.001），固縮細胞減少（圖3），故選擇20 mJ/cm2進行后續實驗。

圖2 5 mg/mLTFPS對不同劑量UVB照射后HaCaT細胞活力的影響

圖3 臺盼藍染色結果

2.3 不同濃度TFPS（0、1、2、3、4、5 mg/mL）對UVB照射HaCaT細胞活力的影響

HaCaT 細胞在接受20 mJ/cm2UVB照射后，細胞活力均明顯下降，實驗組細胞經1、2、3、4、5 mg/mL濃度的TFPS處理后，細胞活力較空白組均明顯增加（P<0.05），且臺盼藍染色結果顯示實驗組陽性細胞數較空白組明顯減少（p<0.001）。

本研究的多組實驗結果表明銀耳多糖安全無毒，可促進HaCaT細胞增殖，有效提高UVB照射后HaCaT細胞活力。

圖4 不同濃度TFPS對UVB照射后HaCaT細胞活力的影響

3 結論

研究顯示銀耳多糖（TFPS）預處理可以降低細胞內ROS含量，過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化物質活性顯著增加，還可以通過上調Nrf2和下調 Keap1表達保護人真皮成纖維細胞[10]。TFPS可通過抑制蛋白激酶B、p38絲裂原活化蛋白激酶、核轉錄因子-κB（NF-κB）的激活來降低脂多糖處理的RAW264.7細胞內ROS水平，還可以顯著抑制促炎細胞因子的表達[11,12]。

本研究結果顯示，1～5 mg/mL的銀耳多糖（TFPS）安全性好，可提高HaCaT細胞被UVB照射后降低的細胞活力，研究結果表明銀耳多糖（TFPS）能夠促進起到抗光損傷的作用，推測可能與抗氧化作用相關，具體仍有待后續研究。本研究結果為TFPS在具有抗光老化活性的功能護膚品或修復皮膚光損傷治療藥物方面的應用提供了實驗依據。