淫羊藿、女貞子含藥血清聯合糖皮質激素影響雷帕霉素誘導ASMCs自噬激活的機制研究*

王 瀚 龍玉婷 馬紫童 李玉曼 馬再娜 于 萍 劉仁慧（首都醫科大學，北京 100069）

近年來，哮喘的發病率和死亡率均呈現上升趨勢，如何干預哮喘發生發展已經成為廣大學者的研究重點。基于氣道炎癥及氣道重塑是哮喘的重要病理改變的認識，抗炎及改善氣道重塑是防治哮喘的重要治療策略［1］。糖皮質激素因具有強大的抗炎作用，是目前治療哮喘的首選藥物，但對氣道重塑的改變并不理想，且應用劑量過大或時間過長會出現多種不良反應［2］。氣道平滑肌細胞（ASMCs）增殖是氣道重塑的關鍵環節，亦是氣道阻塞的主要原因，調控ASMCs功能可有效改善哮喘氣道重塑，并成為治療難治性哮喘的重要思路。

自噬是真核細胞對受損蛋白質或細胞器包裹進行溶酶體降解和再循環，維持細胞核機體穩態的一個過程。適度的自噬可重建細胞穩態，促進細胞生存；但過度自噬加重細胞損傷而致細胞自噬性死亡，或引發凋亡。有研究發現，人哮喘肺中支氣管平滑肌厚度的增加與自噬標記物的高表達密切相關［3］，且哮喘小鼠ASMCs自噬水平顯著上調［4］。平補腎中陰陽立法的淫羊藿-女貞子藥對出自上海市名老中醫徐輝光教授數十年臨床經驗總結［5］。前期研究表明，淫羊藿、女貞子配伍可協同激素抑制卵蛋白誘導的哮喘大鼠膠原纖維沉積及杯狀細胞增生，減少氣道平滑肌增厚，對氣道重塑具有良好的改善作用［6-8］，機制與上調肺組織凋亡水平，下調自噬水平有關，但對于ASMCs的影響未明。本研究通過體外培養的ASMCs，比較激素地塞米松、淫羊藿-女貞子藥對及中西藥合用對自噬激活劑雷帕霉素（Rap）誘導的ASMCs自噬、凋亡及增殖活性的調節作用的差異，為中西藥合用治療哮喘研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠，1月齡，體質量（120±10）g，用于氣道平滑肌原代細胞株提取；SPF級健康雄性SD大鼠，2月齡，體質量（280±20）g，用于含藥血清和正常血清制備。大鼠均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2016-0011，動物倫理號：AEEI-2019-136。

1.2 藥物與試劑

炙淫羊藿飲片40 g（北京人衛中藥飲片廠）；酒女貞子飲片30 g（北京盛世龍藥業有限公司），制成生藥濃度0.7 g/mL的水煎液備用。地塞米松（MedChemExpress公司，批號：38633）。Rap（MedChemExpress公司，批號：38921）；噻唑藍（MTT，索萊寶生物科技有限公司；批號：715F0521）；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒（明輝生物，批號：A91125）；兔抗微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）多克隆抗體（MEDICAL&BIOLOGICAL LABORATORIES，cat.no.M186-3）；小鼠抗P53多克隆抗體（cat.no.sc-98）、小鼠抗Bcl-2多克隆抗體（cat.no.sc-7382）均由Santa Cruz Biotechnology公司提供；兔抗Bax多克隆抗體（cat.no.50599-2-Ig）、兔抗Caspase-3多克隆抗體（cat.no.19677-1-AP）、小鼠抗mTOR單克隆抗體（cat.no.66888-1-Ig）、抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒均由Proteintech公司；兔抗Ki-67單克隆抗體（cat.no.ab16667）、兔抗Beclin-1多克隆抗體（cat.no.ab62557），均來自Abcam；兔抗磷酸化mTOR（phosphomTOR，p-mTOR）單克隆抗體（cat.no.5536）、小鼠抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）單克隆抗體（cat.no.19245）、兔抗GAPDH單克隆抗體（cat.no.2118），購于Cell Signaling Technology公司。

1.3 含藥血清制備

2月齡SD大鼠20只，隨機分為正常組（等體積的蒸餾水）、中藥組（淫羊藿-女貞子水煎液5 mL/kg體質量）。各組大鼠連續灌胃給藥7 d，每日2次。末次給藥1 h后，腹腔麻醉，腹主動脈取血，分離血清，56℃水浴30 min滅活，0.22 μm濾器過濾除菌，分裝，-20℃儲存。

1.4 原代ASMCs培養及給藥

參考文獻［9］分離大鼠ASMCs，并進行純化、α-SMA免疫組化染色鑒定，培養至P3～P7代用于實驗。隨機分為5組：正常組（正常大鼠血清）、Rap組（Rap+正常大鼠血清）、激素組（Rap+正常大鼠血清+地塞米松）、中藥組（Rap+中藥含藥血清）、合用組（Rap+中藥含藥血清+地塞米松）。在孔板或培養皿中以適宜密度接種細胞，于培養箱內靜置培養12 h后，按照分組加入大鼠血清，并加入適量10 μmol/L Rap使培養基含有Rap終濃度為100 nmol/L，48 h后進行檢測。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 電鏡觀察細胞超微結構 10 mL培養皿收集細胞，2.5%戊二醛固定細胞，制備超薄切片，透射電子顯微鏡（TEM）不同視野下觀察細胞內雙層膜結構的自噬體形態、膜內線粒體、內質網碎片等細胞器成分以及凋亡的細胞影像學特征。

1.5.2 MTT法檢測細胞活力 96孔板中加入MTT溶液（5 mg/mL）15 μL，培養4 h。棄上清液，加150 μL二甲基亞砜，搖床震蕩15 min后于490 nm處測OD值，計算細胞活力（%）。

1.5.3 免疫細胞化學法檢測增殖蛋白Ki-67蛋白表達 在含有爬片的24孔板中進行細胞接種、干預，爬片樣本分別進行固定、透膜、內源性過氧化物酶失活、封閉處理，滴加50 μL Ki-67抗體（1∶250稀釋），4℃過夜孵育；次日進行二抗孵育、DAB染色、蘇木素復染、封片，200倍鏡下隨機選取3個視野拍照分析，計算陽性率（%）=（陽性染色細胞核平均area值/全部細胞核平均area值）×100%。

1.5.4 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡率 6 cm培養皿收集細胞按Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書步驟進行操作，使用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.5.5 Western blotting檢測 在10 cm培養皿中收集ASMCs，BCA法蛋白定量；SDS-PAGE電泳分離蛋白（IC3采用12.5%SDS-PAGE凝膠；P53、Caspase-3采用10%SDS-PAGE凝膠），轉移至PVDF膜后封閉2 h；加入一抗（兔抗LC3B、兔抗Caspase-3、鼠抗β-actin、兔抗GAPDH，均1∶1 000；鼠抗P53，1∶500），4℃孵育過夜；加入二抗（山羊抗兔或山羊抗小鼠，均1∶10 000）孵育1 h，化學發光法顯色，凝膠成像系統掃描分析條帶灰度。見圖1。

圖1 各組大鼠LC3蛋白表達

1.5.6 細胞免疫熒光法檢測 24孔細胞爬片經4%多聚甲醛室溫固定，PBS洗；0.5%TritonX-100室溫透膜10 min，PBS洗；5%BSA封閉1 h，吸棄液體；滴加10 μL一抗（兔抗Bax，1∶250；鼠抗Bcl-2，1∶50；兔抗Beclin-1、鼠抗mTOR、兔抗p-mTOR，均1∶100），4 ℃過夜孵育；37℃復溫15 min，PBS洗，滴加100 μL熒光二抗稀釋液1 h，PBS沖洗；抗熒光猝滅封片劑（含DAPI）封片，熒光顯微鏡下（200倍）計算平均光密度值（MOD）。

1.6 統計學處理

應用SPSS21.0統計軟件，分析數據是否服從正態分布：符合正態分布的數據以（）表示，對于多組獨立樣本比較采用方差齊性檢驗及單因素方差分析，根據方差齊性結果選擇LSD（方差齊）或Tamhane'T2（方差不齊）；非正態分布的數據采用秩和檢驗方法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組ASMCs超微結構比較

見圖2。正常組細胞形態較為完整，胞內含細胞器豐富，分布均勻且形態規則，少見自噬小體與凋亡發生現象。Rap組可明顯觀察到細胞邊緣不規則式改變，胞內自噬溶酶體數目大量增加，自噬體形態結構紊亂，細胞凋亡現象增多。激素組多見凋亡小泡分布于細胞膜邊緣，細胞器排列雜亂，可見不同程度的結構破壞；胞內可見不同階段的自噬體，同時伴隨溶酶體髓鞘樣折疊。中藥組與合用組可見細胞膜較為完整，相比于Rap組細胞凋亡減少；胞內自噬體數目下降、線粒體數目增多，內質網排列則較為規則。

圖2 各組大鼠ASMCs透射電鏡圖

2.2 各組ASMCs自噬調節情況比較

見表1。ASMCs在自噬誘導劑Rap刺激下，LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著升高（P＜0.01），Beclin-1蛋白表達顯著升高（P＜0.01），自噬抑制因子mTOR及p-mTOR顯著下調（P＜0.01）。與Rap組比較，激素組LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值進一步升高（P＜0.05），且p-mTOR進一步降低（P＜0.01）；中藥組與合用組LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著降低（均P＜0.05），并見Beclin-1蛋白表達顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；合用組p-mTOR蛋白表達降低（P＜0.05）。合用組較激素組LC3Ⅱ/Ⅰ、mTOR蛋白表達有統計學差異（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組ASMCs自噬調節情況比較（±s）

表1 各組ASMCs自噬調節情況比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與Rap組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與激素組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別正常組Rap組激素組中藥組合用組n 3 3 3 3 3 LC3Ⅱ/Ⅰ1.13±0.16 2.20±0.18**2.57±0.28#1.75±0.15#△△1.76±0.23#△△Beclin-1 37.53±5.30 66.82±7.81**61.07±6.99 48.82±4.18##△53.71±5.19#mTOR 83.47±8.93 45.79±6.45**36.54±5.07 46.64±6.28 49.05±5.50△p-mTOR 93.02±11.01 63.26±7.86**40.10±9.80##69.11±7.28△△48.44±9.08#

2.3 各組ASMCs增殖及凋亡活性的比較

見表2。正常ASMCs經Rap誘導自噬后，細胞活力及Ki-67蛋白表達均顯著下降且凋亡率增加（均P＜0.01）。與Rap組比較，激素組細胞活力、Ki-67蛋白表達均進一步顯著降低（均P＜0.01），且凋亡率進一步升高（均P＜0.01）；中藥組與合用組細胞活力及Ki-67蛋白表達升高（均P＜0.01）；中藥組凋亡率降低（P＜0.01）。與激素組比較，合用組對細胞活力、增殖活性及凋亡活性的影響差異均有統計學意義（均P＜0.01）。

表2 各組ASMCs增殖及凋亡活性的比較（±s）

表2 各組ASMCs增殖及凋亡活性的比較（±s）

組別正常組Rap組激素組中藥組合用組n3 3 3 3 3細胞活力（%）100.00±1.85 56.49±1.99**50.34±1.47##66.37±1.48##△△64.75±1.72##△△Ki-67 Area（%）27.60±1.66 20.23±1.06**17.23±1.50##26.29±1.09##△△23.44±1.71##△△凋亡率（%）10.63±1.16 19.21±2.21**23.48±1.76##13.36±1.72##△△19.56±1.13△△

2.4 各組ASMCs凋亡調節因子表達的比較

見表3。Rap刺激ASMCs出現凋亡活性增強時，Bax、Caspase-3及P53蛋白上調（P＜0.05或P＜0.01），但Bcl-2蛋白下調（P＜0.01），且Bax/Bcl-2增加（P＜0.01）。與Rap組比較，激素組與合用組Bax蛋白進一步升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白顯著降低（P＜0.01），且Bax/Bcl-2比值顯著增加（P＜0.01）；激素組Caspase-3及P53蛋白上調（P＜0.05或P＜0.01）；中藥組P53蛋白降低。與激素組比較，合用組對Bax/Bcl-2、Caspase-3、P53的影響差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組ASMCs凋亡調節因子表達的比較（±s）

表3 各組ASMCs凋亡調節因子表達的比較（±s）

組別正常組Rap組激素組中藥組合用組n 3 3 3 3 3 Bax 65.01±7.93 88.85±7.29*116.48±15.38#93.95±13.67△115.12±14.88#Bcl-2 79.42±7.85 60.26±5.72**38.63±5.45##63.70±5.45△△45.71±5.01##Bax/Bcl-2 0.83±0.18 1.48±0.19**3.02±0.20##1.49±0.35△△2.52±0.20##△Caspase-3 96.07±10.07 165.58±17.35**217.19±21.62##148.81±15.77△△169.68±17.82△△P53 28.85±4.87 52.45±6.13**67.13±7.26#41.15±4.50#△△47.85±7.41△△

3 討論

哮喘是一種復雜的異質性疾病，伴有自發性支氣管收縮和氣流阻塞。ASMCs增生和中央氣道增厚是哮喘嚴重程度的指標和特征［10-11］。自噬是發生在所有真核細胞中的基本生理過程，可調節細胞穩態。經過遺傳多態性研究發現，自噬蛋白ATG5的rs12212740基因位點參與哮喘的發病機制，其等位基因Grs12212740被確定為哮喘的危險因素［12］。哮喘患者大小氣道壁的上皮和ASMCs自噬標志物表達均上調。在體外實驗中證實，TGF-β1可通過刺激人ASMCs自噬和促纖維化信號傳導誘發氣道重塑，而自噬抑制劑氯喹可抑制該作用，改善哮喘氣道重塑［10，13］。

mTOR是進化保守的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可參與細胞增殖、自噬、蛋白質內源合成與代謝等多種生物過程，在自噬途徑中主要通過啟動ULK1與PI3K-Ⅲ復合物分解程序而阻斷自噬體形成［14］。Rap是吸水鏈霉菌的大環內酯類產物，是mTOR的原型抑制劑，通過抑制mTORC1信號傳導發揮免疫抑制和細胞增殖抑制作用，是自噬的強誘導劑［15］。然而，Rap在哮喘中的作用尚未完全闡明。Rap可通過抑制mTORC1信號通路，促進哮喘模型小鼠調節性T細胞分化，改善哮喘氣道炎癥［16］。Rap可改善香煙煙霧誘導的哮喘模型小鼠的氣道炎癥及氣道高反應性［17］，但加重屋塵螨誘導的哮喘模型小鼠的氣道炎癥及氣道高反應性［18］。本研究證實，Rap可顯著刺激誘導正常ASMCs自噬活性，且增加ASMCs LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值、Beclin-1表達，顯著抑制mTOR及p-mTOR表達；同時伴有ASMCs細胞活力及增殖活性抑制，而凋亡水平增加，同時促凋亡蛋白Bax、Caspase-3及P53表達上調，抑凋亡蛋白Bcl-2表達下調，Bax/Bcl-2比值增加。

激素可協同Rap誘導ASMCs自噬活性增加，使LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值進一步增加，并抑制p-mTOR表達，但對Beclin-1及mTOR表達無影響；激素可使Rap刺激的ASMCs細胞活力及增殖活性降低，而凋亡水平增加，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3及P53上調，但抑凋亡蛋白Bcl-2表達下調，且Bax/Bcl-2增加。提示激素可加重Rap誘導的ASMCs自噬與凋亡水平，并進一步抑制ASMCs細胞活力與增殖活性。

中藥淫羊藿、女貞子配伍后可抑制Rap誘導ASMCs自噬活性，使LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin-1蛋白降低，但對mTOR及p-mTOR表達無影響；改善Rap對ASMCs細胞活力及增殖活性的抑制作用，并降低凋亡水平，抑制P53蛋白表達。而中藥合用激素后，可抑制Rap誘導的ASMCs自噬，下調LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值及Beclin-1、p-mTOR蛋白表達；上調Rap誘導的ASMCs細胞活力及增殖活性，但對凋亡活性無顯著影響；與激素單用比較，合用組下調LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，調節ASMCs細胞活力、增殖活性及凋亡活性差異均有統計學意義。提示中西藥合用后可抑制激素協同Rap誘導的ASMCs過度自噬狀態，并改善激素導致的ASMCs活性抑制，使ASMCs趨于正常。

綜上所述，對于Rap誘導的ASMCs自噬及凋亡增強且增殖抑制狀態，激素可進一步加重Rap誘導的ASMCs自噬及凋亡水平，并抑制ASMCs增殖；中藥淫羊藿、女貞子配伍可改善Rap誘導的ASMCs自噬及凋亡水平，促進ASMCs增殖；激素合用中藥可一定程度地抑制Rap協同激素誘導的ASMCs自噬，恢復細胞活性，使細胞趨于正常。