腦心通膠囊對大鼠心梗后心室重構的影響研究*

伍啟華 蔡海榮 趙 帥 劉淑玲 張為章 陳伯鈞，，3，4 曾 靖，3，4△

（1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510004；2.廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120；3.廣東省中醫(yī)急癥研究重點實驗室，廣東 廣州 510102；4.廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院中醫(yī)藥防治心血管急癥臨床研究團隊，廣東 廣州 510006）

急性心肌梗死是冠狀動脈堵塞導致心肌缺血缺氧，引起心肌細胞大量壞死、凋亡的疾病。心肌梗死由于神經內分泌因子分泌而導致心室重構，進而引起心臟收縮和舒張功能的改變，最終進展為慢性心力衰竭［1］。心力衰竭是各種心血管疾病的終末期，5年病死率高達52.6%［2］，已經超越腫瘤。據統計，我國目前現有冠心病患者1 100萬，心力衰竭患者890萬［3］，心肌梗死已經成為心力衰竭最主要的原因，而心力衰竭是心肌梗死患者死亡的主要原因。心室重構是指心肌細胞凋亡、壞死、自噬、增生，繼發(fā)細胞外基質改變，最終引起心肌纖維化。因此，有效治療心室重構對改善心肌梗死患者的預后具有重要的意義。

氧化應激是心室重構的重要啟動基質，還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶（NOX）主要存在于心肌組織中，心肌梗死后心肌細胞凋亡、壞死可以促進NOX表達上升，進而導致活性氧（ROS）分泌增加、堆積，產生細胞毒性，引起心室重構［4-5］。LXRα是配體依賴性的核受體超家族成員，在膽固醇轉運、動脈粥樣硬化、心肌肥厚、心肌纖維化等方面具有重要的作用［6］。本課題組前期基礎研究表明，腦心通膠囊可以減少心肌梗死面積和改善心功能［7-9］，但是對心梗后心室重構的作用尚未明確。因此，本研究復制了大鼠心肌梗死后心室重構模型，給予腦心通膠囊干預，觀察腦心通膠囊對心梗后心室重構的改善并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠40只，5～6周齡，體質量（200±10）g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2018-0002。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境：光照和黑暗每天各12 h，溫度19～27℃，濕度50%～70%，通風換氣每8～12小時1次。

1.2 藥物與試劑 1）藥品：腦心通膠囊［規(guī)格：0.4 g/粒，陜西步長制藥有限公司，國藥準字Z20025001］，阿托伐他汀鈣片（規(guī)格：10 mg/粒，輝瑞制藥有限公司，國藥準字J20171062）。2）試劑：Masson染液套裝（武漢純度生物科技有限公司，貨號DC389）；Trizo（lMRC，貨號Invitrogen）；M-MLV Reverse Transcriptase（Promega，貨號M3682）；GoTaq（R）qPCR Master Mix（Promega，貨號A6100）；中性樹膠（北京凱瑞基生物科技有限公司，貨號87226）；蘇木素染液（廣州威佳科技有限公司，貨號G1080）。

1.3 實驗儀器 動物呼吸機（南京卡爾文生物科技有限公司）；成像系統［徠卡顯微系統（上海）貿易公司］；倒置熒光顯微鏡［徠卡顯微系統（上海）貿易公司］；紫外可見分光光度計（武漢純度生物科技有限公司）；紫外透射分析儀（太倉市華利達實驗設備有限公司）；基因擴增儀（Hema）；Real-time Quantitative PCR（Bio-Rad）。

1.4 模型制備 大鼠經2.5%阿佛丁腹腔注射麻醉后固定于手術臺上，胸腹部和頸部備皮。碘伏消毒頸部皮膚后沿頸部中線剪開皮膚，分離肌肉和甲狀腺，暴露氣管，將氣管導管插入大鼠氣管中，調整呼吸機頻率、潮氣量、呼吸比等。然后用碘伏消毒胸部皮膚，橫向剪開大鼠左側乳頭下方2 cm處的皮膚，分離肌肉至胸膜，剪開胸膜，暴露心臟，胸腔內放置棉球固定心臟。尋找左心耳后確定冠狀動脈左前降支的位置，用5-0縫合線縫扎左前降支，結扎后可見左心室變白，室壁運動減弱。關閉胸腔，注射器抽吸胸腔積液和積氣，逐層縫合肌肉和皮膚。斷開呼吸機，縫合頸部皮膚。假手術組只開胸不結扎冠狀動脈左前降支。1周后行Doppler超聲檢測，若左心室射血分數（EF）＜40%則判定為心肌梗死后心室重構模型構建成功。

1.5 分組和給藥 將心肌梗死后心室重構模型構建成功大鼠隨機分為模型組、腦心通組、他汀組。按照《藥理實驗方法學》［10］計算大鼠藥物劑量，他汀組給予阿托伐他汀鈣片20 mg（/kg·d）灌胃，腦心通組給予腦心通膠囊378 mg（/kg·d）灌胃，模型組和假手術組給予等體積的生理鹽水灌胃，灌胃時間為4周。

1.6 指標檢測 1）心臟超聲檢測：在灌胃4周結束后，采用Doppler超聲檢測大鼠的心功能，包括左室舒張末期內徑（LVDd）、左室收縮末期內徑（LVDs）、左室射血分數（LVEF）、短軸收縮率（FS）、每搏輸出量（SV）、心排血量（CO）。2）QPCR檢測心肌組織LXRα mRNA、NOX mRNA、COLⅠmRNA、COLⅢ mRNA的表達：心臟超聲檢測結束后，大鼠腹腔注射麻醉劑，剪開胸腔，剪取心臟組織，保存于-80℃冰箱。檢測時提取心室總RNA，逆轉錄合成cDNA，以GAPDH為內參，進行QPCR擴增試驗，檢測各因子mRNA表達水平。引物序列采用Primer Express5.0設計，引物序列如下。LXRα上游引物：TGATGTTCCCACGGATGCTA，下游引物：GCCAACACAGAGGACACGG；NOX2上游引物：CAGGA TGGAGGTGGGACAA，下游引物：GTCGCCAACAATG CGGATA；COI上游引物：GCCCAGTTTGGTATCAAA GGT，下游引物：AAAAGGAACATTTGCTGGTCT；COⅢ上游引物：GCCTCCCAGAACATTACATACC，下游引物：CCAGTGTGTTTAGTGCAGCCAT。QPCR擴增試驗結束后，檢測各樣本的Ct值，然后計算相對表達量。3）ROS檢測：采用 DCFH-DA（2，7-Dichlorofuorescin Diacetate）探針檢測心肌組織ROS的相對熒光度。4）HE染色：剪取心臟組織用甲醛固定后，脫水機脫水，石蠟包埋，切片機切片，烘箱內烤片，脫蠟，蘇木素和伊紅染色，脫水封片，置于顯微鏡下觀察。5）Masson染色：心肌組織制成石蠟切片后脫蠟，分別重鉻酸鉀、鐵蘇木素、麗春紅酸性品紅染色、磷鉬酸染色、苯胺藍染色，分化，透明封片，顯微鏡下觀察。

1.7 統計學處理 應用SPSS26.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間采用單因素方差分析，兩兩間比較采用LSD-t法檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌組織HE染色結果 見圖1。HE染色示假手術組大鼠心肌結構正常；模型組大鼠可見大量增生的纖維結締組織和炎性細胞浸潤；腦心通組和他汀組大鼠心肌纖維結締組織減少，炎性細胞浸潤較輕，正常心肌細胞較模型組多。

圖1 各組大鼠心肌組織（HE染色，200倍）

2.2 各組大鼠心肌組織Masson染色結果 見圖2。Masson染色示假手術組大鼠心肌結構正常，無纖維化組織；模型組大鼠可見膠原纖維結締組織增生；腦心通組和他汀組大鼠膠原纖維結締組織增生較模型組輕。

圖2 各組大鼠心肌組織（Masson染色，100倍）

2.3 各組大鼠心功能指標比較 見表1。灌胃4周結束后，與假手術組比較，模型組大鼠LVIDd、LVIDs升高，LVEF、FS、SV、CO降低，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，腦心通組大鼠LVIDd、LVIDs降低，LVEF、FS、SV、CO升高，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心功能指標比較（±s）

表1 各組大鼠心功能指標比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別假手術組模型組腦心通組他汀組n 10 10 10 10 LVIDd 5.96±0.30 9.20±0.79*6.67±0.49△6.53±0.37△LVIDs 3.67±0.39 7.57±0.91*4.32±0.32△4.03±0.23△LVEF 61.92±3.53 26.54±4.86*53.93±5.26△57.90±3.41△FS 35.17±2.21 16.35±1.81*31.60±2.62△32.89±2.36△SV 130.33±4.10 92.09±3.33*121.34±7.24△124.72±5.78△CO 53.38±7.16 32.86±7.24*42.89±4.92△48.74±6.45△

2.4 各組大鼠心肌LXRα、NOX、COLⅠ、COLⅢmRNA和ROS表達水平比較 見表2。灌胃4周結束后，與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織LXRα mRNA表達降低，NOX、COLI、COLⅢ mRNA表達水平和ROS活性增加，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，腦心通組大鼠心肌組織LXRα mRNA表達增加，NOX、COLI、COLⅢmRNA表達水平和ROS活性降低，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠心肌LXRα、NOX、COLI、COLⅢmRNA和ROS表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠心肌LXRα、NOX、COLI、COLⅢmRNA和ROS表達水平比較（±s）

組 別n LXRα mRNA NOX mRNA ROS COLI mRNA COLⅢmRNA假手術組模型組腦心通組他汀組10 10 10 10 1.02±0.10 0.37±0.08*0.87±0.10△1.05±0.30△1.02±0.10 3.25±0.27*1.11±0.15△0.94±0.07△1.01±0.08 3.10±0.37*1.25±0.17△1.11±0.12△1.09±0.17 2.98±0.27*1.13±0.18△0.83±0.15△1.00±0.13 3.16±0.21*1.22±0.23△0.89±0.13△

3 討論

心肌梗死屬于中醫(yī)學“胸痹”范疇，中醫(yī)學認為氣虛血瘀是心肌梗死后心室重構的核心病機［11］。《素問·痹論》曰“心痹者，脈不通……倘若心陽不振，則搏動無力，致血行緩滯而積瘀”。氣與血相互為用，氣為血之帥，氣行則血行，心肌梗死患者多為中老年人群，正氣虧虛，心氣不足，心主血脈，心氣虛則無力推動血行，血行瘀滯，瘀血內生，痹阻血脈，不通則痛；且瘀血為有形之邪，瘀血留滯心絡、心肌，隨著病程進展，瘀血日漸堆積，引起血管狹窄、增生和心肌增厚等。因此，心肌梗死后心室重構應以益氣活血為法則。腦心通膠囊出自補陽還五湯，方中黃芪重用為君，補氣益氣，氣足則心脈通暢，心有所主。地龍活血通絡，全蝎息風通絡，水蛭破血消癥，3藥合用為臣，活血化瘀，通絡止痛。川芎為血中之氣藥，理氣活血；牛膝活血化瘀；當歸、雞血藤補血活血，活血不傷正；紅花活血痛經；桃仁活血化瘀；赤芍涼血活血；丹參活血化瘀、清心除煩。8味藥合用為佐，加強活血化瘀功效。桂枝溫陽通經，桑枝通經絡，二藥合用為使藥，引藥入心絡、血脈。諸藥合用，共奏益氣活血功效。已有研究發(fā)現，腦心通膠囊具有減少心肌梗死面積和改善心功能的作用［7-8］。

心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生率為25%［12］，一旦出現心力衰竭，心肌梗死患者的病死率明顯升高。心室重構是心肌梗死發(fā)生心力衰竭的重要機制，主要表現為心肌細胞凋亡、壞死、自噬、纖維化，進一步導致心室壁增厚和心腔擴大，LVEF下降。HE染色可以顯示心肌組織形態(tài)結構、心肌細胞排列循序和纖維化等，Masson染色可以直接顯示心肌組織膠原纖維增生的程度。本研究結果顯示，假手術組大鼠心肌細胞排列有序，未見纖維化和炎性細胞浸潤等病理改變；模型組大鼠正常細胞心肌細胞大部分消失，代之以增生的纖維細胞，并可見炎性細胞浸潤，提示模型組大鼠出現了心室重構。而經過腦心通膠囊干預后大鼠正常心肌細胞增多，心肌纖維化程度減輕。Masson染色示假手術組大鼠心肌組織無膠原纖維增生，模型組大鼠可見大量膠原纖維增生，而腦心通膠囊干預后心肌組織膠原纖維減輕。提示腦心通膠囊可以減輕心肌梗死后心室重構大鼠的纖維化。

心肌梗死后心室重構會出現心力衰竭，心功能是臨床上重要評價指標。心室重構患者心室壁增厚，心腔增大，故LVIDd和LVIDs增大，而心肌收縮能力下降，故LVEF、FS、SV、CO均降低。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠LVIDd、LVIDs升高，EF、FS、SV、CO降低；經過腦心通膠囊干預后，大鼠LVIDd、LVIDs降低，EF、FS、SV、CO升高。提示腦心通膠囊可以抑制心肌梗死后心室重構和改善心功能。

LXRα是配體依賴性的核受體超家族成員，在調節(jié)膽固醇轉運、動脈粥樣硬化、炎癥反應方面均起到重要的作用。有研究指出，LXRα基因敲除小鼠出現心肌細胞凋亡、壞死、纖維化，減少心臟血管新生，從而加重心室重構［13］。氧化應激也是心室重構的重要機制，氧化應激主要是氧化應激物質產生過多或機體抗氧化能力不足，導致ROS堆積，產生細胞毒性，引起心肌細胞凋亡、壞死、膠原纖維增生和纖維化，發(fā)生心室重構。NOX2是ROS生成的主要來源，NOX2主要存在于心肌細胞中，心肌梗死后心肌分析大量NOX2，催化大量ROS生成，引起氧化應激損傷［14］。細胞外基質是心肌細胞外的主要成分，主要包括膠原和成纖維細胞。心肌梗死后ROS可以激活金屬基質酶家族，促進成纖維細胞分泌大量的Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維，導致心肌纖維化和疤痕形成［15］。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌LXRα mRNA表達降低，NOX、COLI、COLⅢmRNA表達水平和ROS活性增加；腦心通膠囊干預后大鼠心肌LXRα mRNA表達升高，NOX、COLI、COLⅢmRNA表達水平和ROS活性下降；提示腦心通膠囊可以上調LXRa mRNA的表達，抑制NOX、COLI、COLⅢmRNA的表達水平和ROS活性。

綜上所述，腦心通膠囊可能通過上調LXRα mRNA，抑制NOX、COLI、COLⅢ mRNA的表達和ROS活性，從而延緩心肌梗死后心室重構。