一種消減醬豆中游離酪氨酸的耐鹽菌的篩選及應用研究

黃豆醬是一類以大豆和面粉為主要原料，經米曲霉等微生物發酵而成的一種色、香、味俱全的傳統發酵食品。黃豆醬中人體所需的營養物質比較豐富，這些營養物質經微生物分解后，更容易被人體吸收，也可以改善人體的腸道環境。在黃豆醬發酵過程中，許多微生物起著重要作用，米曲霉是主要的微生物，也包括芽孢桿菌、乳酸菌、霉菌、酵母菌等。

我國豆醬種類中黃豆醬的產量最大，對黃豆醬的整個發酵過程的研究比較深入。黃豆醬主要采用米曲霉進行制曲，大曲成熟后，與鹽水混合，制成黃豆醬胚。黃豆醬胚的鹽分較高，使得大量霉菌生長受到抑制，進而導致其呼吸代謝逐漸減弱直至停止，但有些適應該環境的耐鹽或耐酸微生物開始大量繁殖。發酵初期的黃豆醬胚中，米曲霉分泌的各種酶發揮了主要作用。原料中的蛋白質被蛋白酶、肽酶降解為多肽、氨基酸等小分子物質[1]；淀粉、纖維素等多糖物質被淀粉酶降解為小分子的葡萄糖。黃豆醬發酵中期，耐鹽酵母菌和乳酸菌利用發酵初期形成的葡萄糖等物質代謝生成乙醇、乳酸等呈味物質。在黃豆醬的發酵后期，需定期翻、曬、露，以便通過陽光紫外線照射，使溫度白天高晚上低，形成溫度差，進而使發酵黃豆醬胚中各種有益菌種得到繁殖和生長，增加醬豆酯香。

傳統的黃豆醬釀造工藝都是先將黃豆浸泡好，去掉泡豆水后將黃豆蒸煮，然后再進行制曲和發酵，制成黃豆醬胚。但在黃豆醬發酵過程中，物料在蛋白酶、肽酶等酶的作用下，分解成多肽和氨基酸，氨基酸中的酪氨酸因溶解度僅為0.045%，很容易在釀造過程中析出，產生白點，嚴重影響黃豆醬的外觀品質[2-3]。

制曲過程中大曲發酵產生的酶系難以控制，無法直接控制蛋白質的水解過程不產生酪氨酸[4-5]。因此，為減少發酵產物中的酪氨酸水平，采取“添加消耗酪氨酸的耐鹽菌”的工藝，在后發酵過程中分解利用酪氨酸為氮源。這樣既減少了發酵產物中的酪氨酸，亦不增加發酵成本，提升了黃豆醬發酵產物的感官品質，降低了黃豆醬在釀造過程中的白點風險，提升了黃豆醬整體經濟效益。

本文通過篩選消減酪氨酸的耐鹽菌，用于黃豆醬釀造工藝。在黃豆醬發酵過程中，耐鹽菌消耗醬豆中游離的酪氨酸，有效降低黃豆醬發酵后期醬醪中游離酪氨酸的含量，使黃豆醬中游離酪氨酸的含量＜100 mg/100 g，從而避免了黃豆醬在貨架期產生白點的風險[6-7]。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

釀造黃豆醬生產原料：黃豆、面粉、食鹽從市場采購；滬釀3.042米曲霉菌種：由廣東美味鮮調味食品有限公司提供；葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、麥芽汁培養基、MRS肉湯培養基和瓊脂粉等從市場購買。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺、培養箱、耐鹽菌擴培系統、種曲機、NK式旋轉蒸煮鍋、發酵池、60 m3發酵罐等。

1.3 試驗方法

1.3.1 分離培養基及分離方法

檢測不同發酵罐中酪氨酸的含量，從低游離酪氨酸含量的發酵罐中取醬醪樣品，進行分離。

耐鹽乳酸菌的分離：MRS培養基（1 L）、食鹽

100 g、碳酸鈣3 g，采用包埋法進行分離。

耐鹽酵母菌的分離：麥芽汁培養基（1 L）、食鹽

100 g、瓊脂粉20 g，采用平板涂布法進行分離。

1.3.2 耐鹽菌的菌落形態和菌體顯微形態

觀察分離得到的耐鹽菌的菌落形態，用牙簽挑取少量菌體置于載玻片上，滴加少量的蒸餾水，蓋上蓋玻片，然后通過顯微鏡觀察耐鹽菌的顯微形態。

1.3.3 小試規模確定目標耐鹽菌消減游離酪氨酸的效果

①耐鹽菌的制備。將目標耐鹽菌按照現有工藝進行擴大培養，得到擴培液，備用。②醬醪的制備。取200 g成熟大曲，與濃度為18%的300 g鹽水混合均勻，盛裝于1 L三角瓶中，制得新鮮的醬醪。③耐鹽菌的添加。菌種的添加比例為醬醪的5%；試驗一：將耐鹽酵母菌添加于新鮮的醬醪中；試驗二：將耐鹽乳酸菌添加于新鮮的醬醪中；試驗三：將耐鹽酵母菌和乳酸菌分別按照5%醬醪比例添加至同一瓶的新鮮醬醪中，添加自來水于醬醪中的樣品為對照樣品。④醬醪發酵。將醬醪于30 ℃左右進行發酵，分別取發酵時間為7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和63 d的醬豆樣品，送檢樣品的游離酪氨酸指標，根據游離酪氨酸的含量變化，確認分離得到的耐鹽菌降低游離酪氨酸效果。

1.3.4 小試規模優化目標耐鹽菌的添加工藝

分別取發酵時間為7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和63 d的醬豆樣品，送檢樣品的游離酪氨酸指標，通過單因素試驗，分別確定目標耐鹽菌的最佳添加時間、添加量、添加后起效時間。

1.3.5 中、大試規模驗證耐鹽菌消減酪氨酸的效果

將篩選的目標耐鹽菌按照生產工藝進行擴大培養，得到擴培液，備用。取成熟的大曲，與濃度為16%的鹽水按照1∶2.0的比例進行混合制醪，泵至60 m3發酵罐中，將耐鹽菌擴培液，分別按照5%的添加比例添加至醬醪中，以未添加擴培液的發酵罐為對照罐，常溫發酵，取7 d、14 d、21d、28 d、35d、42 d、49 d、56 d和63 d的醬豆樣品，檢測主要理化指標。

1.3.6 各指標檢測方法

（1）游離酪氨酸測定。參照GB 5009.124—2016使用高效液相色譜法[8]。

（2）理化指標測定。總酸參照GB 12456—2021使用自動電位滴定法測定；氨基酸態氮參照GB 5009.235—2016使用酸度計法測定；還原糖參照GB 5009.7—2016使用直接滴定法測定；鹽分參照GB/T 5009.39—2003使用直接滴定法測定。

2 結果與分析

2.1 篩選得到的耐鹽菌及其菌落形態和顯微鏡形態

由表1可知，一共分離得到了8株耐鹽菌，其中有4株為酵母菌，1株為短桿菌，2株球形細菌，1株乳酸菌，分離得到的耐鹽菌大部分為酵母菌。

表1 從新鮮醬醪中分離的菌種編號、形態和類型表

2.2 小試規模確定目標耐鹽菌消減游離酪氨酸的效果

由表2可知，菌1和菌4分別添加到醬醪中，在發酵至20 d左右時，醬豆中游離酪氨酸含量大大降低，這兩株耐鹽菌消減酪氨酸效果最好。

表2 不同醬豆中游離酪氨酸含量變化情況表

2.3 小試規模優化目標耐鹽菌的添加工藝

2.3.1 耐鹽菌的添加時機確定

由表3可知，在發酵0 d、14 d、28 d、42 d的醬醪中添加耐鹽菌，均能使醬豆中的游離酪氨酸下降，但在發酵0 d即投料當天添加耐鹽菌，消減游離酪氨酸的效果最好。

表3 不同添加時機發酵醬豆中游離酪氨酸的含量表

2.3.2 耐鹽菌的添加比例確定

由表4可知，按0.5%、1.0%添加到醬醪中消減酪氨酸的效果不明顯，添加2.5%、5.0%和10.0%的耐鹽菌到醬醪中降酪氨酸的效果明顯。說明添加耐鹽菌的量是降低酪氨酸的一個關鍵參數，菌量少，達不到降酪氨酸的效果。添加比例為2.5%時，消減酪氨酸效果也非常明顯，但發酵前期還是存在高含量的游離酪胺酸，耐鹽菌慢慢生長起來后，酪氨酸下降較快，但是存在白點隱患；5.0%和10.0%的添加量對降酪氨酸的效果差別不大，說明添加5.0%的耐鹽菌已經飽和，添加5.0%以上的菌量對降酪氨酸的效果提升影響不大，故添加量最適為5.0%。

表4 不同添加比例發酵醬醪中酪氨酸的含量表

2.3.3 耐鹽菌的起效時間確定

由表5可知，在發酵0 d添加耐鹽菌，每周送檢醬豆中游離酪氨酸，判斷耐鹽菌的起效時間。在發酵初期，0～7 d時，實驗組醬豆中游離酪氨酸含量隨著發酵時間的增加而增加，在發酵14～21 d，游離酪氨酸含量消減迅速，說明添加的耐鹽菌在醬醪中14～21 d作用明顯。

表5 確定消減酪氨酸的耐鹽菌的起效時間表

由表1～5可知，在低酪氨酸的醬醪中篩選到了2株消減游離酪氨酸的耐鹽菌，一株為酵母菌，另外一株為乳酸菌，對其關鍵參數進行驗證，說明在發酵投料時就添加該2株耐鹽菌，單個菌株添加量為5%，或者混合菌株添加量為5%時，對消減醬豆中的游離酪氨酸效果最好。添加該耐鹽菌后，耐鹽菌在發酵14～21 d，大大降低醬豆中游離酪氨酸，解決白點隱患。

2.4 目標耐鹽菌添加到黃豆醬工藝的中試驗證

由表6可知，與對照組相比，添加了耐鹽菌菌1、菌4、菌1+菌4混合菌的試驗組的黃豆醬中游離酪氨酸大大降低，幾乎檢不出來，且試驗組的理化指標和風味、顏色與對照組沒有明顯區別。說明添加黃豆醬耐鹽菌酵母菌，既能降低黃豆醬游離酪氨酸的含量，也沒有對理化指標、風味、顏色等造成負面影響，篩選到的耐鹽菌降酪氨酸效果較好，達到了預期目標。

表6 試驗組與對照組發酵黃豆醬胚理化指標表

2.5 目標耐鹽菌添加到黃豆醬工藝的大試驗證

由表7可知，與對照組相比，添加了耐鹽菌菌1、菌4、菌1+菌4混合菌的試驗組的黃豆醬中游離酪氨酸大大降低，幾乎檢不出來，且試驗組的理化指標和顏色與對照組沒有明顯區別，添加耐鹽菌的風味均優于對照組，同時添加耐鹽乳酸菌和酵母菌的醬豆風味優于添加單一耐鹽菌的，醬香味更濃郁。

表7 試驗組與對照組發酵黃豆醬胚理化指標表

3 結論

低酪氨酸含量的黃豆醬樣品中，分離得到2株消減游離酪氨酸效果明顯的菌株，分別為酵母菌和乳酸菌；將這2株耐鹽菌同時用于黃豆醬釀造工藝，在醬醪配制階段添加5%的耐鹽菌，發酵20 d左右時，使黃豆醬中的游離酪氨酸含量控制在＜100 mg/100 g，從而避免了黃豆醬在貨架期產生白點的風險。添加耐鹽菌工藝釀造的黃豆醬在總酸、氨基酸態氮、鹽分等主要理化指標方面與對照樣無明顯差異，黃豆醬風味有所提高，在解決黃豆醬白點的基礎上提高了黃豆醬品質，實現了黃豆醬工藝的升級。