四溴乙基環己烷對綠豆種子萌發和幼苗生長的影響

時曉麗,楊 洋,張會茹,羅愛國

(晉中學院生物科學與技術系，山西晉中 030619)

四溴乙基環己烷(tetrabromoethylcyclohexane)，又名1,2-二溴-4-(1,2-二溴乙基)環己烷(TBECH或DBE-DBCH)，是一種被廣泛用于泡沫塑料、黏合劑、塑料制品和電力電纜涂料等材料的新型溴代阻燃劑(NBFRs)。TBECH被認為是傳統溴代阻燃劑多溴聯苯醚(PBDEs)和六溴環十二烷(HBCDs)的潛在替代品。研究表明，TBECH具有潛在的環境持久性和長距離遷移性，其較高的親脂性(log=5.24)意味著TBECH具有潛在的生物富集性和放大性。TBECH已被美國環保署列入環境關注的化合物。

截至目前，TBECH在環境介質、生物體內、甚至非職業暴露人群的血清中被檢出。TBECH的生物毒性效應受到廣泛關注。體外試驗和對魚類、鳥類等體內試驗研究表明，TBECH具有內分泌干擾毒性、神經毒性、免疫毒性和腎毒性。此外，TBECH具有多模式內分泌干擾作用，包括雌激素、抗雄激素和甲狀腺激素等毒性作用。目前關于TBECH的毒性效應多集中在水生生物和動物體內。但是，關于新型溴代阻燃劑TBECH對植物毒性的影響才開始受到關注。

土壤是溴代阻燃劑重要的匯，溴代阻燃劑進入土壤后迅速與土壤有機質結合。因此，溴代阻燃劑的生物富集與土壤有機質的含量和性質有關。植物是陸地生態系統的基本生命組成部分，能夠吸收、富集和代謝一定濃度的有機污染物，如殺蟲劑、雙酚類似物和阻燃劑等。有機污染物可以通過植物吸收進入食物鏈，從而對野生動物和人類健康造成風險。為了更好地了解植物對有機污染物的生化和分子反應，有必要檢測有機污染物的植物毒性。目前，關于傳統溴代阻燃劑(如PBDEs)的植物毒性效應已經有了較為深入的研究。PBDEs能夠誘導植物細胞產生過量活性氧(ROS)，引起玉米根細胞膜脂過氧化、蛋白羰基化和DNA雙鏈斷裂等損傷，影響植物組織和細胞的正常代謝過程，最終導致植物生長受到抑制甚至死亡。西葫蘆和蘿卜通過自身吸收轉運PBDEs到地上部分來減少其在環境中的含量，提高土壤中PBDEs的生物有效性，進而增加人類暴露風險。

綠豆(L.)屬于豆科草本植物，富含多種營養物質，且具有強的固氮能力，可以有效改善土壤肥力，是我國的主要糧食作物之一。該研究采用綠豆為受試植物，探究TBECH對綠豆種子萌發和幼苗生長的影響，通過測定種子發芽率、發芽勢、干重、鮮重以及幼苗株高、根長、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性來初步研究TBECH對綠豆的毒性效應，為評價TBECH對綠豆的毒性作用提供科學依據。

1 材料與方法

供試綠豆為大同小明綠豆種子(購自中國農業科學研究院)。TBECH(純度>95%)購自上海艾美克生化有限公司。其他試劑購自北京化學試劑公司，均為分析純。

配制不同濃度(0、60、120、180 μg/L)的TBECH溶液備用。選擇大小相近飽滿的綠豆為供試植物。3% HO對綠豆種子處理30 min，用蒸餾水進行反復沖洗。

種子暴露：在鋪有2層濾紙的培養皿中各放置10粒綠豆種子，并加入25 mL不同濃度暴露液。對照組用等量的去離子水培養，每個處理設置3個平行。將種子置于25 ℃相對空氣濕度80%的恒溫培養箱中進行避光培養。幼苗暴露：發芽4 d后，將長勢均一的綠豆幼苗轉移至錐形瓶進行暴露，每瓶放置10顆幼苗，每個處理設置3個平行。置于25 ℃恒溫培養箱中培養，白天光照14 h，暗培養10 h。每天更換暴露溶液以消除濃度改變的影響。在每個暴露瓶外部用鋁箔包裹以防TBECH發生光解。

從綠豆暴露第2天起，每天記錄露白數、發芽數、根長至種子體長1/2數。分別在第3天和第6天，計算每個處理種子的發芽勢和發芽率。

發芽率=第6天供試綠豆種子發芽數/總種子數×100%

發芽勢=第3天供試綠豆種子發芽數/總種子數×100%

鮮重的測定。發芽試驗結束后，定性濾紙吸干水分，用電子天平稱量15粒綠豆種子的總鮮重。每個濃度各取3個平行組種子鮮重的平均值。

干重的測定。發芽試驗結束后，分別從各組中隨機選取5粒綠豆種子，放入電熱恒溫鼓風干燥箱中于105 ℃下烘15 min后調至80 ℃烘干至綠豆種子恒重，用電子天平稱其干重。每個濃度各取3個平行組干重的平均值。

選取生長狀況良好、長勢相似的9株幼苗，連續5 d進行根長、株高的測量。將綠豆植株水平放置，直接用尺子測量株高。由于根部彎曲脆弱故采用細線測量，做好標記后用尺子測量標記長度，觀察在不同濃度下綠豆生長狀況的變化。

用無菌水清洗綠豆幼苗，拭去水分，稱取幼苗鮮樣0.3 g置于玻璃研磨器中，在冰浴中加少量石英砂，用5 mL KHPO將幼苗研磨成勻漿，轉入離心管，4 ℃ 4 000 r/min離心15 min，取上清液，即得到樣品粗酶液。

采用Bradford法，以牛血清蛋白為標準測定幼苗中的蛋白含量。采用愈創木酚法測定POD的活性，在470 nm波長下測定其吸光度，根據吸光度計算POD活性。采用紫外吸收法測定CAT活性，在波長240 nm下測定其吸光度，根據吸光度計算CAT活性。

利用GraphPad Prism 5進行統計學分析。數據分析采用多組獨立樣本(≥3)單因素方差分析，<0.05表示數據具有統計學意義。

2 結果與分析

暴露于不同濃度TBECH(0、60、120、180 μg/L)溶液中綠豆種子的發芽率、發芽勢、鮮重和干重見圖1。從圖1可以看出，隨著TBECH濃度的增加，TBECH對種子發芽率和發芽勢的影響無顯著差異。與對照組相比，綠豆種子的鮮重和干重隨著TBECH濃度的增加而顯著下降。在60～180 μg/L，鮮重從3.37 g下降到2.91 g，干重從100.08 mg下降到75.67 mg。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)圖1 不同濃度TBECH對綠豆種子發芽率、發芽勢、鮮重和干重的影響Fig.1 Effects of different concentrations of TBECH on germination rate, germination potential,fresh weight and dry weight of Vigna radiata seeds

從圖2可以看出，TBECH對綠豆幼苗莖的伸長有顯著的抑制作用且具有濃度依賴性(<0.05)。與對照組相比，當TBECH濃度為180 μg/L時，株高由5.4 cm降低至3.4 cm，僅為對照組的63.0%。TBECH處理5 d后，根系生長形態出現顯著變化。隨著暴露濃度的增加，主根和側根變短，側根數量減少，且主根出現斷裂的情況。TBECH濃度達到180 μg/L時，主根的根長由4.9 cm 降低至0.9 cm,是對照組的18.4%(<0.05)。TBECH對幼苗主根生長的抑制作用高于對莖的抑制，可能是由于根部富集的有機污染物濃度較高的原因。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)圖2 不同濃度TBECH對綠豆幼苗株高和根長的影響Fig.2 Effects of different concentrations of TBECH on plant height and root length of Vigna radiata seedlings

不同濃度TBECH溶液處理綠豆幼苗5 d后，測定綠豆幼苗中2種抗氧化酶POD和CAT的活性變化(圖3)。從圖3可以看出，隨著暴露濃度的增加，POD的活性呈上升趨勢；當暴露濃度為60、120、180 μg/L時，處理組幼苗POD的活性顯著升高，分別是對照組的1.3、2.0和2.1倍(<0.05)。CAT的活性隨著TBECH暴露濃度的增加而顯著升高；濃度為180 μg/L時，CAT的活性達到最大值，是對照組的3.2倍。該研究結果表明在最高濃度的TBECH處理下，POD和CAT活性顯著增加，表明TBECH能夠誘導綠豆幼苗發生氧化損傷，導致綠豆幼苗生長延遲。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)圖3 不同濃度TBECH對綠豆幼苗抗氧化酶POD和CAT活性的影響Fig.3 Effects of different concentrations of TBECH on the activities of antioxidant enzymes POD and CAT in Vigna radiata seedlings

3 小結與討論

種子萌發期間的生長狀況直接影響著植物的生長發育和產量。目前，已有多種苗期生長指標用于研究多溴聯苯醚、六溴環十二烷等有機污染物的生態毒理學效應。該研究選用綠豆作為受試植物，研究不同濃度TBECH對綠豆種子萌發和幼苗生長的影響。將綠豆種子和幼苗暴露于0～180 μg/L TBECH中，發現TBECH能夠抑制綠豆種子的萌發和幼苗生長；TBECH能夠顯著降低種子的鮮重和干重等生物量，但對種子發芽率和發芽勢的影響無顯著差異。Xu等研究發現多溴聯苯醚BDE-47、6-OH-BDE-47和6-MeO-BDE-47均能夠抑制玉米種子的萌發，暴露濃度為5 μg/L 時，玉米種子的發芽率分別為76.2%、73.6%和66.3%，與該研究的結果不一致。王練書研究發現100 mg/kg高溴代阻燃劑BDE-209能夠降低玉米的發芽率，與該研究的結果一致。據報道，PBDEs通過影響植物的結構和功能，破壞色素體膜系統、類囊體、線粒體結構，進而抑制植物的生長發育。綠豆種子生物量的顯著下降表明，TBECH可能通過種皮滲透進入植物細胞，影響細胞質膜的組分、透性和運輸等，進而損害膜的正常生理功能，破壞細胞的代謝作用。張瓊等研究發現3 mg/L 4,4′-二溴聯苯醚(BDE-15)能夠顯著降低纖細裸藻的蛋白含量，抑制率達69.70%。為了抵御TBECH的侵害，種子呼吸作用增強，從而進一步影響綠豆的代謝作用。

該研究發現TBECH對綠豆幼苗莖的伸長有顯著的抑制作用且具有濃度依賴性。當TBECH濃度為180 μg/L 時，株高僅為對照組的63.0%。隨著暴露濃度的增加，主根和側根變短，側根數量減少，且主根出現斷裂的情況。TBECH對幼苗主根生長的抑制作用高于對莖的抑制，可能是根部富集的有機污染物濃度較高的原因。Wu等研究發現六溴環十二烷(HBCD)能夠抑制玉米的生長，HBCD對根的抑制率(31.94%)顯著高于對莖葉的抑制率(11.97%)。玉米地上部分對β-HBCD的總富集量低于根部，主要通過根部吸收和莖向傳輸2種方式進行積累。謝顯傳研究發現100 mg/kg十溴聯苯醚(BDE-209)對黑麥草株高和根長的抑制率均為25%。李麗華等研究發現1 000 mg/kg BDE-209使紫花苜蓿的根長減小20.7%，芽長減小18.3%。趙良元研究發現30 mg/kg BDE-209對水蔥產生毒性作用，使水蔥的株高和莖粗分別降低34.4%和28.1%。以上發現均與該研究的結果一致。植物的根是污染物與植物的第一個接觸點，污染物對植物根系生長的抑制作用會影響營養物質在植物內的吸收和運輸，進而影響莖的伸長。

在污染物脅迫下，植物各組織細胞產生的活性氧增加，這是植物中毒的普遍表現。如果不及時清除，會導致脂質過氧化、DNA損傷和酶活性喪失等效應。植物具有由POD和CAT組成的抗氧化防御系統，在清除氧化脅迫產生的活性氧方面發揮重要作用。植物中毒癥狀較輕時，植物通過增大抗氧化酶活性來清除活性氧。隨著中毒癥狀的加重，植物的生命力快速下降，抗氧化應激能力隨之減弱直至消失，抗氧化酶活性出現低促高抑的現象。在植物體清除ROS過程中POD和CAT起關鍵作用，POD和CAT催化HO發生歧化反應生成HO和O。隨著污染物暴露濃度的增加，HO水平逐漸升高，最終超過抗氧化酶的清除能力，導致氧化損傷的發生。抗氧化酶表達水平的改變被認為是ROS產物觸發氧化應激的指示物。該研究結果發現幼苗抗氧化酶POD和CAT的活性隨TBECH濃度的增加而顯著提高，最高濃度180 μg/L TBECH的暴露誘導POD和CAT活性顯著增加，分別是對照組的2.1和3.2倍，表明TBECH的脅迫誘導綠豆幼苗發生氧化應激，從而導致綠豆幼苗生長延遲。綠豆為了阻止超氧化物自由基和羥基自由基的形成，激活了綠豆體內的抗氧化酶活性，進而保護細胞膜系統免受損害。孟范平等研究發現低濃度2，2′，4，4′-四溴聯苯醚(BDE-47)(0.1和1.0 μg/L)處理海水小球藻24 h能夠誘導其SOD和CAT酶活性增加，隨著暴露時間的延長這2種酶的活性受到抑制。BDE-209處理雜交狼尾草，其CAT酶活性也呈現先上升后下降的趨勢。武彤等研究發現β-HBCD能夠誘發玉米體內抗氧化酶系統的應激反應，SOD和APX(抗壞血酸過氧化物酶)活性出現先增加后降低的趨勢，與該研究的結果不一致。王丹研究發現TBECH能夠誘導玉米體內活性氧累積量增多和抗氧化酶CAT、SOD和POD基因表達上調，與該研究的結果一致。

綜上所述，TBECH對綠豆具有毒性作用，在綠豆種子中，TBECH能夠顯著降低種子的鮮重和干重等生物量，但對種子發芽率和發芽勢的影響無顯著差異。在綠豆幼苗中，TBECH對綠豆幼苗莖根的伸長有顯著的抑制作用且具有濃度依賴性，TBECH對幼苗主根生長的抑制作用高于對莖的抑制。幼苗抗氧化酶POD和CAT的活性隨TBECH濃度的增加而顯著提高。氧化應激可能是導致植物毒性的關鍵因素。該研究為更全面地了解TBECH的環境行為和毒性效應提供了有價值的信息。為了闡明TBECH對綠豆的致毒機制，今后有必要使用組學技術結合分子生物學手段進行進一步研究。