宣肺止嗽合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

李成明，王 瑞，張明童，李冬華，馬 瀟，朱仁愿

(1.甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部，甘肅蘭州 730050；2.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，甘肅蘭州 730050；3.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅省中藏藥檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070)

宣肺止嗽合劑為《中國(guó)藥典》2020年版(一部)收載品種，由荊芥、前胡、桔梗、蜜罌粟殼等10味中藥組成，具有疏風(fēng)宣肺、止咳化痰之功效，用于治療風(fēng)邪犯肺證咳嗽、癥見(jiàn)咳嗽、咽癢、鼻塞流涕、惡寒發(fā)熱、咯痰。現(xiàn)代臨床研究表明，宣肺止嗽合劑可明顯改善感冒后遺咳嗽，對(duì)治療細(xì)菌性肺炎引起的咳嗽、痰多效果明顯。方中蜜罌粟殼主要含嗎啡等生物堿成分，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳和抑制呼吸等藥理作用，連續(xù)服用易產(chǎn)生依賴(lài)性、癮癖，超劑量使用會(huì)出現(xiàn)呃逆、呼吸困難、昏迷等中毒癥狀。鑒于此，應(yīng)對(duì)嗎啡的含量進(jìn)行嚴(yán)格控制。宣肺止嗽合劑的含量測(cè)定最早收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部，起草宣肺止嗽合劑含量測(cè)定方法時(shí)未充分考慮其原料藥罌粟殼蜜制之后嗎啡含量的變化以及原料藥與成藥之間的轉(zhuǎn)移率，導(dǎo)致含量合格的蜜罌粟殼原料藥進(jìn)行投料出現(xiàn)含量不合格的宣肺止嗽合劑。另外《中國(guó)藥典》2020年版一部采用HPLC法測(cè)定嗎啡含量，但所用有機(jī)溶媒毒性強(qiáng)、前處理煩瑣、易造成待測(cè)充分嗎啡損失，同時(shí)對(duì)色譜柱的要求也較高。因此，該研究擬建立簡(jiǎn)便易行的測(cè)定宣肺止嗽合劑中嗎啡含量的HPLC法，考察罌粟殼中嗎啡轉(zhuǎn)移率，制定較為合理的宣肺止嗽合劑中嗎啡限量標(biāo)準(zhǔn)，為宣肺止嗽合劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

Waters E2695型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；ME24-102型萬(wàn)分之一電子天平、XS205DU十萬(wàn)分之一型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-250E數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

嗎啡對(duì)照品(批號(hào)171201-201324，含量≥93.9%)，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，磷酸為優(yōu)級(jí)純，甲醇為分析純，水為超純水。5批罌粟殼藥材購(gòu)自甘肅普安制藥有限公司，經(jīng)馬瀟主任藥師鑒定為罌粟科植物罌粟(L.)的干燥成熟果殼，參照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0213蜜炙法制成蜜罌粟殼5批，每100 kg罌粟殼用20 kg煉蜜；以蜜罌粟殼為原料制成的宣肺止嗽合劑，每批蜜罌粟殼制3批合劑，共計(jì)15批。

對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取嗎啡對(duì)照品11.88 mg，置于25 mL容量瓶中，加含5%磷酸的20%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻后取1 mL置于25 mL容量瓶中，加入5%磷酸的20%甲醇，制成質(zhì)量濃度為0.017 991 mg/mL的嗎啡對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備。精密量取宣肺止嗽合劑樣品2 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加含5%磷酸的20%甲醇溶液，密塞，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再繼續(xù)用含5%磷酸的20%甲醇溶液加至刻度，搖勻，即得。

空白對(duì)照溶液的制備。按照處方比例稱(chēng)取除蜜罌粟殼的其他藥材適量，依照宣肺止嗽合劑制法制得陰性對(duì)照樣品，再按“..”方法制得空白對(duì)照溶液。

色譜條件。資生堂CAPCELL PAK CMG色譜柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫：0～12 min，3% A→5%A；12～13 min，5% A→20%A；13～18 min，20%A；18～20 min，20% A→3% A；20～23 min，3%A；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

方法學(xué)考察。

線(xiàn)性關(guān)系考察。取嗎啡對(duì)照品溶液適量，加含5%磷酸的20%甲醇溶液配制0.004 448、0.008 896、0.022 240、0.044 480、0.088 960、0.222 394 mg/mL的系列濃度，進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為橫坐標(biāo)、濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

精密度試驗(yàn)。取嗎啡對(duì)照品溶液10 μL(濃度為0.044 480 mg/mL)，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算嗎啡峰面積的RSD。

重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批宣肺止嗽合劑(編號(hào)S-X5-1)平行制備6份供試品溶液，計(jì)算嗎啡含量的RSD。

穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一批宣肺止嗽合劑(編號(hào)S-X5-1)制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算嗎啡含量的RSD。

加樣回收率試驗(yàn)。采用加樣回收法，分別精密量取已知嗎啡含量的宣肺止嗽合劑(編號(hào)S-X5-1)樣品9份，分3組，取樣量各為1 mL，精密加入低、中、高(0.5倍、1.0倍、1.5倍)3個(gè)濃度的嗎啡對(duì)照品，按照“..”方法制備供試品溶液，并按“..”色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算加樣回收率。

樣品測(cè)定。按照《中國(guó)藥典》2020年版一部“罌粟殼”項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)定5批次罌粟殼和蜜罌粟殼中嗎啡的含量；再取15批次宣肺止嗽合劑，分別精密量取2 mL，按照“..”方法制備供試品溶液，以“..”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中嗎啡的含量。

蜜炙系數(shù)計(jì)算。5批罌粟殼分別以蜜炙法炮制，每100 kg罌粟殼用20 kg煉蜜，平均每批制成約118.5 kg的蜜罌粟殼，則在蜜罌粟殼中的罌粟殼實(shí)際占有量為98.75 kg，即蜜罌粟殼中的嗎啡含量理論值計(jì)算如下：

根據(jù)蜜罌粟殼中嗎啡含量實(shí)測(cè)值與理論值差異，計(jì)算蜜炙系數(shù)，公式如下：

轉(zhuǎn)移率計(jì)算。依據(jù)蜜罌粟殼及其對(duì)應(yīng)投料生產(chǎn)出的宣肺止嗽合劑中嗎啡含量測(cè)定結(jié)果計(jì)算轉(zhuǎn)移率，公式如下：

×100%

2 結(jié)果與分析

系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。對(duì)照品、供試品和空白對(duì)照色譜圖見(jiàn)圖1。圖1表明，在“..”色譜條件下，對(duì)照品和供試品色譜圖中嗎啡的保留時(shí)間為12 min左右，空白對(duì)照色譜圖中在該處無(wú)其他色譜峰干擾。

圖1 對(duì)照品(a)、供試品(b)和空白對(duì)照(c)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance (a), test substance (b) and blank control (c)

線(xiàn)性關(guān)系考察。按“...”方法操作，以峰面積為橫坐標(biāo)、濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得出嗎啡線(xiàn)性方程為=5 671-12 002(=0999 9)，結(jié)果表明，嗎啡在0.004 448～0.222 394 mg/mL呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)。按“...”方法操作，測(cè)得嗎啡峰面積的RSD為0.2%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)。按“...”方法操作，測(cè)得嗎啡含量的RSD為1.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“...”方法操作，測(cè)得嗎啡含量的RSD為0.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收率試驗(yàn)。按“...”方法操作，結(jié)果見(jiàn)表1，從表1可以看出，平均加樣回收率為96.30%，RSD為2.4%，表明該方法回收率良好，可用于宣肺止嗽合劑中嗎啡的含量測(cè)定。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

由表2可知，罌粟殼中嗎啡的含量為2.773～3.971 mg/g，蜜罌粟殼中嗎啡的含量為2.396～3.917 mg/g，宣肺止嗽合劑中嗎啡的含量為0.078～0.128 mg/mL。

表2 罌粟殼、蜜罌粟殼和宣肺止嗽合劑中嗎啡含量(n=3)

試驗(yàn)結(jié)果顯示(表3)，蜜罌粟殼中嗎啡含量實(shí)測(cè)值與理論值存在一定差異，蜜炙系數(shù)為0.94～1.23，平均為1.10。

表3 蜜炙系數(shù)結(jié)果

從表4可以看出，宣肺止嗽合劑中嗎啡含量的轉(zhuǎn)移率為53.6%～70.0%，平均轉(zhuǎn)移率為64.2%。

3 結(jié)論與討論

供試品溶液萃取溶劑的優(yōu)化。藥典中宣肺止嗽合劑嗎啡含量測(cè)定采用酸水-堿化-萃取法處理，即用含5%醋酸的20%甲醇溶液提取。該試驗(yàn)考察了三氯甲烷-氨水、乙酸乙酯-氨水作為萃取溶劑的萃取效果，但考慮到嗎啡為兩性化合物，在酸性條件下(pH 3～5)較為穩(wěn)定，故也考察了5%醋酸的20%甲醇、5%磷酸的20%甲醇溶液的提取效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，堿液的提取率沒(méi)有明顯高于酸溶液，并且在液相譜圖上磷酸的試劑峰明顯小于乙酸峰，對(duì)嗎啡的對(duì)照峰干擾最低。最終確定試驗(yàn)萃取溶劑為5%磷酸的20%甲醇溶液。

表4 轉(zhuǎn)移率計(jì)算結(jié)果

供試品提取方式的選擇。藥典中該試驗(yàn)前處理煩瑣、有機(jī)溶媒消耗量大、費(fèi)時(shí)且易造成樣品中嗎啡成分的損失，所以對(duì)樣品中嗎啡進(jìn)行了多種提取方法的比較研究：方法①加入氨水2 mL，用25 mL乙酸乙酯萃取；方法②直接超聲提取法，結(jié)果顯示，方法②較方法①提取率高、簡(jiǎn)便易行。故該試驗(yàn)簡(jiǎn)化了提取方法，使樣品的前處理操作簡(jiǎn)單易行。

提取中因素的比較。參照有關(guān)文獻(xiàn)，考察供試品溶液取樣量、溶劑加入量、超聲時(shí)間3個(gè)因素對(duì)宣肺止嗽合劑中嗎啡含量測(cè)定的影響。在此基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)優(yōu)化了測(cè)定宣肺止嗽合劑中嗎啡含量的步驟。試驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)因素對(duì)嗎啡含量的影響程度依次為取樣量(A)>溶劑加入量(B)>超聲時(shí)間(C)；宣肺止嗽合劑中含量最佳的提取條件為取樣量2 mL、溶劑加入量10 mL、超聲時(shí)間30 min。

參照有關(guān)文獻(xiàn)，考察3種流動(dòng)相(乙腈-含0.1%甲酸的0.02 mol/L乙酸銨溶液、甲醇-0.1%三乙胺0.02 mol/L乙酸銨、乙腈-0.1%磷酸水)，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210～250 nm。對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用乙腈-0.1%磷酸水作為流動(dòng)相時(shí)，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，得到較好的峰性和分離度。

根據(jù)宣肺止嗽合劑處方量，每1 000 mL制劑含蜜罌粟殼50 g，《中國(guó)藥典》2020年版一部中規(guī)定，罌粟殼和蜜罌粟殼中嗎啡含量按干燥品計(jì)算應(yīng)為0.06%～0.40%，則宣肺止嗽合劑中每1 mL嗎啡含量理論值應(yīng)為0.030～0.200 mg。該試驗(yàn)通過(guò)考察宣肺止嗽合劑生產(chǎn)工藝，結(jié)果顯示，罌粟殼經(jīng)蜜炙后，實(shí)際測(cè)得嗎啡含量高于理論值，即蜜炙系數(shù)>1，平均值為1.10；生產(chǎn)過(guò)程中，嗎啡轉(zhuǎn)移率平均為64.2%。結(jié)合以上，推算每1 mL宣肺止嗽合劑中的嗎啡含量0.021～0.141 mg/mL。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，15批宣肺止嗽合劑中嗎啡含量實(shí)際結(jié)果在0.078～0.128 mg/mL，平均值為0.105 mg/mL，與推算結(jié)果一致。

罌粟殼和蜜罌粟殼以嗎啡作為含量測(cè)定指標(biāo)。其嗎啡既是有效成分也是有毒成分，久用易于成癮。故在制定罌粟殼中嗎啡的限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，以罌粟殼的處方最大使用量，以及嗎啡的每日允許攝入量、平均體重和服用天數(shù)進(jìn)行折算，但是宣肺止嗽合劑中使用的是蜜罌粟殼，所以在限量制定過(guò)程中不僅要考慮罌粟殼生產(chǎn)出成品的轉(zhuǎn)移率，也要考慮到罌粟殼經(jīng)過(guò)蜜炙后的轉(zhuǎn)移率。經(jīng)過(guò)對(duì)樣品測(cè)得實(shí)際數(shù)據(jù)與理論數(shù)據(jù)分析，罌粟殼與蜜罌粟殼有一定的轉(zhuǎn)移系數(shù)也就是蜜炙系數(shù)。蜜炙系數(shù)平均值為1.10，最大值為1.23，也就是說(shuō)盡管蜜炙罌粟殼經(jīng)炮炙后占比量少于罌粟殼，但嗎啡含量較罌粟殼中增加了。所以將蜜炙系數(shù)和轉(zhuǎn)移率這2個(gè)因素綜合考慮后才能完善宣肺止嗽合劑中嗎啡的限量標(biāo)準(zhǔn)制定。