基因工程中載體概述

盛曹穎

（吳江高級(jí)中學(xué) 江蘇蘇州 215200）

在基因工程中，外源基因自身很難進(jìn)入宿主細(xì)胞，且在宿主細(xì)胞內(nèi)不能進(jìn)行正常擴(kuò)增、表達(dá)，許多載體便應(yīng)運(yùn)而生。科學(xué)家根據(jù)其完成的不同生物學(xué)效應(yīng)，將其分為以下幾種：①克隆載體（cloning vector），又稱一般載體，一般在宿主外不能存活，有能自我復(fù)制、分子量小、拷貝數(shù)多等特點(diǎn)，主要用于擴(kuò)增外源DNA片段；② 表達(dá)載體（expression vector），一般具有高強(qiáng)度的啟動(dòng)子和核糖體的結(jié)合序列，能高效地產(chǎn)生較穩(wěn)定的mRNA，主要用于外源DNA在宿主細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)；③穿梭載體（shuttle vector），可用于不同生物間復(fù)制。

在這些載體中，克隆載體是最常見(jiàn)的載體，在基因工程中占有十分重要的地位。目前，科學(xué)家已構(gòu)建和應(yīng)用的克隆載體有數(shù)千種。根據(jù)其構(gòu)建所用的DNA來(lái)源，克隆載體可分為質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體載體等。

1 質(zhì)粒載體

質(zhì)粒（Plasmid）是人們廣泛應(yīng)用的克隆載體。它是細(xì)菌和真菌等細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在的一種環(huán)狀DNA分子。幾乎所有的質(zhì)粒都帶有一個(gè)或多個(gè)基因。質(zhì)粒不影響宿主細(xì)胞的生存，但其帶有特殊功能的基因可以賦予宿主細(xì)胞某些抵御外界不利環(huán)境因素的特性。

1.1 質(zhì)粒的生物學(xué)特性

1.1.1 質(zhì)粒的復(fù)制

幾乎所有的質(zhì)粒都含有復(fù)制起點(diǎn)。質(zhì)粒侵染宿主細(xì)胞后，不同質(zhì)粒復(fù)制的方式不同。根據(jù)是否攜帶一套促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因（稱為基因），質(zhì)粒分為整合型質(zhì)粒和非整合型質(zhì)粒。整合質(zhì)粒可以整合到宿主細(xì)胞染色體的DNA上進(jìn)行復(fù)制，而非整合質(zhì)粒依賴于自身或宿主細(xì)胞體內(nèi)編碼的酶進(jìn)行自主復(fù)制而實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，具體過(guò)程如圖1所示。

圖1 非整合質(zhì)粒和整合質(zhì)粒的復(fù)制過(guò)程模式圖

1.1.2 質(zhì)粒的大小和拷貝數(shù)

質(zhì)粒的大小一般在1～250 kb之間。但是，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)一般小于10 kb的質(zhì)粒才適合用于構(gòu)建克隆載體，而大的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)一定的改造后亦可用于基因克隆。質(zhì)粒拷貝數(shù)是指在某一生物組中能夠找到質(zhì)粒的分子數(shù)，目前對(duì)控制拷貝數(shù)的因素尚未了解，但發(fā)現(xiàn)每個(gè)質(zhì)粒具有的拷貝數(shù)在1～800之間。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)可以應(yīng)用于實(shí)踐的克隆載體需要以大量的拷貝形式存在于細(xì)胞中，才能夠獲得大量的重組DNA。表1列出了幾種常用質(zhì)粒的大小與拷貝數(shù)的關(guān)系。

表1 常用質(zhì)粒載體大小與拷貝數(shù)的關(guān)系

1.1.3 質(zhì)粒的不相容性

質(zhì)粒的不相容性是指利用同一復(fù)制系統(tǒng)的兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象。其原因主要是在同一細(xì)胞中復(fù)制時(shí)，一般不相容的質(zhì)粒具有相同的復(fù)制子，會(huì)存在競(jìng)爭(zhēng)，從而隨機(jī)被淘汰，導(dǎo)致在子細(xì)胞中只存在其中一種質(zhì)粒。

1.1.4 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性

質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性是指在自然條件下，質(zhì)粒通過(guò)細(xì)菌接合作用可以轉(zhuǎn)移到新宿主細(xì)胞內(nèi)。有些質(zhì)粒（如質(zhì)粒pBR322）本身不能進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)移，但含有轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)nic，借助于第三個(gè)質(zhì)粒（如ColK）編碼的轉(zhuǎn)移蛋白的作用，通過(guò)結(jié)合質(zhì)粒來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)移。基因操作中可以在不同的復(fù)制單位上放入轉(zhuǎn)移必需的因子，通過(guò)順?lè)椿パa(bǔ)來(lái)控制目的質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移。

1.2 質(zhì)粒載體的種類

按照不同的方式，質(zhì)粒分類不同。質(zhì)粒的基因所決定的主要特征是天然存在的質(zhì)粒最主要的分類依據(jù)。根據(jù)這一分類方法，質(zhì)粒可分為以下5種：①致育質(zhì)粒，又稱F質(zhì)粒，僅攜帶轉(zhuǎn)移基因，只具有促進(jìn)質(zhì)粒間有性接合轉(zhuǎn)移的特征，如大腸桿菌中的F質(zhì)粒；②藥性質(zhì)粒，又稱R質(zhì)粒，攜帶有能夠賦予宿主細(xì)菌對(duì)某一種或多種抗菌劑的耐藥性基因，如抗氯霉素、氨芐青霉素或水銀；③Col質(zhì)粒，編碼一種能夠殺死其他細(xì)菌的大腸桿菌素蛋白，如大腸桿菌的ColE1質(zhì)粒；④降解質(zhì)粒，使宿主菌能夠代謝一些通常情況下無(wú)法利用的甲苯、水楊酸等分子，如惡臭假單胞菌中的TOL質(zhì)粒；⑤毒性質(zhì)粒，賦予宿主菌致病性，如根瘤農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒，能夠在雙子葉植物中誘導(dǎo)冠癭瘤。

1.3 質(zhì)粒載體的構(gòu)建

由于野生質(zhì)粒往往存在許多缺陷，因此目前使用的質(zhì)粒載體大多是人工構(gòu)建的。每種質(zhì)粒的構(gòu)建思路和過(guò)程都十分相似，都是根據(jù)基因工程的需要，除去一些非必需元件，添加一些必需的元件，使其成為一種帶有多個(gè)單一限制酶切位點(diǎn)、多種強(qiáng)選擇標(biāo)記、低分子質(zhì)量、高拷貝、易于轉(zhuǎn)化、無(wú)感染性等優(yōu)點(diǎn)的理想載體。

1.4 質(zhì)粒載體的應(yīng)用

由于這類載體可以在細(xì)胞內(nèi)維持較高的拷貝數(shù)，有利于擴(kuò)增外源DNA，所以具有非常廣泛的應(yīng)用。例如，早期的pBR系列載體以及現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室常用的Takala公司的pMD18-T載體等。這些載體可以把經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增或經(jīng)聚合酶處理3′末端加A的未知序列的DNA片段直接通過(guò)T-A克隆的方法插入載體，為載體構(gòu)建和未知DNA序列的鑒定提供了更加簡(jiǎn)潔的解決方案。

2 噬菌體載體

與質(zhì)粒相比，噬菌體結(jié)構(gòu)要復(fù)雜些，雖然它們均可用于克隆和擴(kuò)增特定的DNA片段，但是利用噬菌體感染細(xì)胞比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞更為有效，且克隆容量也明顯大于質(zhì)粒，已成為一種不可或缺的基因載體。

2.1 噬菌體載體的生物學(xué)特性

噬菌體是一類細(xì)菌病毒的總稱，不同種類的噬菌體顆粒在形態(tài)結(jié)構(gòu)上差別很大，其感染性強(qiáng)，依賴于細(xì)菌宿主細(xì)胞才能進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖。

2.2 噬菌體載體的種類

目前使用的噬菌體載體主要分為：①λ噬菌體衍生物，是最早使用的克隆載體，分為插入型載體和置換型載體兩類。②柯斯質(zhì)粒，是λ噬菌體cosDNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)DNA序列重組而成，具有兩種載體的優(yōu)點(diǎn)。③單鏈M13噬菌體，作為單鏈DNA載體，可用于基因定位誘變以及單鏈DNA探針制備。

2.3 噬菌體載體的構(gòu)建

由于野生型的噬菌體DNA中含有較多的限制位點(diǎn)，不適合作為基因克隆的載體。因此，構(gòu)建噬菌體載體時(shí)需要切除多余的限制位點(diǎn)以及非必需的區(qū)段，才能將其改造成適用的克隆載體。不同的噬菌體載體構(gòu)建方式不同，λ噬菌體衍生物主要集中在消除多余的限制性酶切位點(diǎn)和去除λDNA中一些對(duì)其生命周期無(wú)關(guān)的非必需區(qū)段；單鏈M13噬菌體先插入一個(gè)大腸桿菌的lac操縱子片段和選擇標(biāo)記，再加入多克隆位點(diǎn)MCS。

2.4 噬菌體載體的應(yīng)用

噬菌體載體主要用于建立cDNA文庫(kù)，具體過(guò)程是先將某種生物的一系列cDNA分子先通過(guò)置換或插入的方法與合適的噬菌體載體重組，或不經(jīng)過(guò)包裝直接轉(zhuǎn)染受體菌細(xì)胞，或在體外包裝成噬菌體顆粒后轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌細(xì)胞。這樣所形成的噬菌斑群體就是該生物個(gè)體的cDNA基因。除此之外，噬菌體載體還可用于克隆外源目的基因，在生化和遺傳學(xué)研究中有著非常廣泛的應(yīng)用。

3 病毒載體

3.1 病毒載體的生物學(xué)特性

病毒復(fù)雜而精致的結(jié)構(gòu)可以高效轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，這是作為載體的基礎(chǔ)。在外源基因?qū)胝婧耸荏w細(xì)胞的各種方法中，最為常用的便是利用病毒載體感染宿主細(xì)胞的途徑，不同的病毒載體具有不同的表達(dá)特點(diǎn)。目前常用的介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的病毒有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和痘病毒等。

3.2 病毒載體的種類

病毒表達(dá)載體大體可分為病毒顆粒載體（插入外源性DNA后，隨病毒的繁殖進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)）和改建的病毒DNA混合型載體（不能形成病毒顆粒，重組體在真核細(xì)胞內(nèi)像質(zhì)粒一樣隨宿主細(xì)胞的基因復(fù)制而復(fù)制）。其中后者是目前廣泛使用的。

3.3 病毒載體的構(gòu)建

目前，科學(xué)家已研究出多種病毒載體，特別是腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其構(gòu)建過(guò)程首先對(duì)病毒的基因組進(jìn)行改造，使之能攜帶相關(guān)的病毒元件和外源基因，之后包裝成重組病毒載體，進(jìn)行侵染。

3.4 病毒載體的應(yīng)用

由于病毒載體可以介導(dǎo)外源基因在真核細(xì)胞中高效表達(dá)，可以用于實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究，如建立特定基因瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，也可以表達(dá)治療性基因用于臨床基因治療，如治療Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥和B型血友病。

4 人工染色體載體

4.1 人工染色體載體的生物學(xué)特性

當(dāng)克隆基因組非常龐大的人類基因組等真核生物基因組時(shí)，往往需要克隆幾百甚至數(shù)十萬(wàn)堿基對(duì)的DNA片段。此時(shí)，克隆載體需要具備更大的承載量，科學(xué)家便建構(gòu)了人工染色體載體。人工染色體載體具備著絲粒、端粒和復(fù)制起始區(qū)域三種必需成分，才能保證其能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地自主復(fù)制、分離，并隨細(xì)胞分裂平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，從而保證人工染色體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性。

4.2 人工染色體載體的種類

人工染色體載體含有天然染色體基本功能單位，目前科學(xué)家已開(kāi)發(fā)出多種類型的人工染色體載體，實(shí)驗(yàn)室常用酵母人工染色體（YAC）、細(xì)菌人工染色體（BAC）、人類人工染色體（HAC）等。

4.3 人工染色體載體的構(gòu)建

不同種類的人工染色體載體的構(gòu)建不同，但是大體原理相同，如將細(xì)菌接合因子、酵母或人類染色體DNA上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)、端粒區(qū)與質(zhì)粒裝配在一起。

4.4 人工染色體載體的應(yīng)用

人工染色體載體主要應(yīng)用于基因分離、基因組圖譜制作以及基因組序列分析，并且在基因治療領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。例如，基因治療過(guò)程中，較大的外源DNA片段和人工染色體重組成功后，通過(guò)電穿孔技術(shù)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，重組體在宿主細(xì)胞內(nèi)作為一條獨(dú)立的染色體進(jìn)行復(fù)制和分裂，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)出正常功能的蛋白，以治療由于基因缺陷或基因突變導(dǎo)致的遺傳疾病。