青藤堿對(duì)腎癌細(xì)胞786-O細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響

謝程國(guó) 馬勝利 張鏡偉

廣州市第一人民醫(yī)院泌尿外科(廣州 511458)

青藤堿(C19H23NO4)是一種生物堿單體，從青藤干燥的根和莖中提取[1]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)青藤堿在細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和血管生成等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[2- 5]。而且，越來越多的研究表明青藤堿具有抗腫瘤作用，例如體外實(shí)驗(yàn)表明青藤堿能抑制肺癌細(xì)胞NCI-H460和白血病細(xì)胞的的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性[6- 7]，同時(shí)也有抗前列腺癌作用[8]。此外，青藤堿還能減少乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。這些結(jié)果闡明了青藤堿在不同腫瘤中的抗腫瘤作用。但是迄今為止，青藤堿在腎癌細(xì)胞中的作用還沒有報(bào)道。因此，在本文中我們擬探討青藤堿對(duì)人腎癌細(xì)胞786-O細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期分部及凋亡的影響，以期為防治腎癌提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)擴(kuò)增和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)買于日本Takara公司；四氮唑藍(lán)鹽(May-Thumer syndrome，MTS)細(xì)胞繁殖定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)置于美國(guó)Promega公司；主要使用的抗體包括c-myc(ab32072，Abcam，美國(guó))， Bax(ab32503，Abcam，美國(guó))，Caspase 3(ab32351，Abcam，美國(guó))，GAPDH (ab8245，Abcam，美國(guó))。青藤堿購(gòu)于上海藍(lán)木化工有限公司(Selleck，S2359)，于DMSO中溶解使其終濃度分別達(dá)到100 μM、150 μM、200 μM、250 μM。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人腎癌細(xì)胞株786-O和正常腎小管細(xì)胞HK- 2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫，HK- 2細(xì)胞在Keratinocyte Serum Free Medium (K-SFM)+1%青霉素和鏈霉素中培養(yǎng)；786-O在含有10%胎牛血清(Gbico)+1%青霉素和鏈霉素組合的RPMI1640 (Gbico)中培養(yǎng)。所有細(xì)胞在37 ℃標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下(5% CO2, 95%濕度)生長(zhǎng)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用Trizol提取786-O細(xì)胞總RNA，通過核酸蛋白定量?jī)x(NanoDrop 2000)測(cè)定所提取RNA的濃度及純度；然后，參照Takara公司的PrimescriptRTReagent Kit試劑盒說明書，將總RNA(1 μg)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；按照PrimeScriptTMRT Master Mix ( Perfect Real Time )試劑盒說明書，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)，所需引物序列如表1所示：

表1 各基因引物序列

記錄各組CT值并采用公式2-ΔΔCT對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，得到各個(gè)細(xì)胞株中基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 蛋白免疫印跡(Western blot，WB)法

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期786-O細(xì)胞，加入1×Cell Lysis Buffer裂解細(xì)胞，經(jīng)超聲、離心后去掉其他細(xì)胞成分，使用BCA蛋白定量分析試劑盒對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量；加入5×SDS加樣緩沖液，煮沸10 min 以使蛋白變性；配液10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜，封閉，并在4 ℃與一抗孵育過夜；二抗室溫孵育2小時(shí)，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)，并進(jìn)行灰度值分析。

1.5 MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

按照MTS細(xì)胞繁殖定量檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟，將100 μL完全培養(yǎng)基中的2 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，在37 ℃和5% CO2下培養(yǎng)1～5天，然后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在培養(yǎng)基中加入10 μL MTS, 37 ℃下孵育4 h后, 490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔吸光度，根據(jù)結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 流式細(xì)胞周期檢測(cè)

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度青藤堿對(duì)786-O細(xì)胞周期的分布。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用PBS清洗3遍后加入不含血清FBS的1640培養(yǎng)基，然后使用預(yù)冷75%乙醇固定細(xì)胞，置于4 ℃過夜；第二日離心去除乙醇，經(jīng)PBS清洗后，加入100 μL RNase A，于37 ℃水浴箱中放置30 min；然后加PI染液于4 ℃冰箱密封避光反應(yīng)1小時(shí)；最后上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)各階段DNA的含量來確定細(xì)胞周期的分布。

1.7 流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化，使用Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒APC (Cat: 88- 8007, ebiosicence)，按照實(shí)驗(yàn)步驟雙染APC偶聯(lián)Annexin V (annexin V-APC)和碘化丙啶(PI)，使用FACSCalibur (BD Bioscience)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。每個(gè)樣本共采集20000個(gè)細(xì)胞，使用BD CellQuest軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度青藤堿對(duì)腎癌細(xì)胞786-O增殖能力的影響

為了探討青藤堿在腎癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用，我們?cè)?86-O細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的青藤堿(培養(yǎng)基中青藤堿終濃度分別為100、150、200、250 μmol/L)。如圖1所示，與DMSO及空白組相比，不同濃度青藤堿均明顯抑制786-O細(xì)胞的增殖能力，且隨著濃度的增高，其抑制作用愈強(qiáng)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。

2.2 青藤堿誘導(dǎo)786-O細(xì)胞周期G1/S期阻滯

我們進(jìn)一步探討青藤堿對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果如圖2所示，空白組和DMSO組細(xì)胞G1期細(xì)胞百分比分別占48.46%、46.76%，S期細(xì)胞百分比分別占34.74%、40.61%，而加入不同濃度青藤堿后，G1期細(xì)胞分別增加到52.10%(100 μmol)，56.93%(150 μmol)，57.60%(200 μmol)，59.32%(250 μmol)，而S期細(xì)胞減少至41.86%(100 μmol)，37.04%(150 μmol)，30.15%(200 μmol)，30.04%(250 μmol)，說明青藤堿可以誘導(dǎo)786-O細(xì)胞周期G1/S期阻滯。

2.3 青藤堿誘導(dǎo)786-O細(xì)胞凋亡

空白組和DMSO組晚期凋亡細(xì)胞百分比分別為0.38%、0.86%，而加入不同濃度青藤堿后，凋亡細(xì)胞百分比分別增加到2.98%(100 μmol)，3.71%(150 μmol)，4.72%(200 μmol)，6.77%(250 μmol)，說明青藤堿可以誘導(dǎo)786-O細(xì)胞凋亡(P<0.05)。見圖3。

2.4 青藤堿對(duì)細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

我們分別用DMSO、青藤堿(200 μmol)處理腎癌786-O細(xì)胞，qRT-PCR與WB分別檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果如圖4所示，青藤堿顯著下調(diào)c-myc蛋白及mRNA水平，而誘導(dǎo)凋亡蛋白Bax、Caspase- 3表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。

3 討 論

近年來，腎細(xì)胞癌在全球的發(fā)病率逐年上升，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年美國(guó)腎細(xì)胞癌新發(fā)病例63 990例，死亡病例14 400例，發(fā)病率約占成人惡性腫瘤的5%[9]。腎小管癌起源于腎近端小管細(xì)胞，透明細(xì)胞癌是最常見的亞型，占轉(zhuǎn)移性腎小管癌的80%～85%[10]。在治療方面，腎細(xì)胞癌對(duì)放療和化療不敏感。雖然手術(shù)切除腫瘤是目前的最佳治療策略，但其術(shù)后復(fù)發(fā)率為20%～40%[11]。而且由于腎小細(xì)胞癌對(duì)放化療有抵抗性，因此缺乏有效的術(shù)后輔助治療[12]。此外，缺乏早期診斷腎細(xì)胞癌的生化標(biāo)志物和隨訪資料，阻礙了腎細(xì)胞癌的及時(shí)診斷。近些年靶向藥物的應(yīng)用為腎癌的治療提供了新的解決途徑。然而不幸的是，隨著靶向藥物應(yīng)用時(shí)間的延長(zhǎng)，患者均會(huì)對(duì)靶向藥物產(chǎn)生耐藥，加大靶向藥物的劑量則會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響了靶向藥物的臨床療效。因此，我們急需發(fā)現(xiàn)新的治療藥物和靶點(diǎn)，以期改善晚期腎癌患者的生存質(zhì)量及生存時(shí)間。

目前，大量證據(jù)表明，許多中草藥提取物具有很強(qiáng)的抗癌能力，如穿心蓮內(nèi)酯[13]、魔芋[14]等。青藤堿是從中草藥青藤中提煉出來的一種異喹啉類生物活性堿。青藤堿對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床治療有顯著的療效已被廣泛報(bào)道[15- 16]。在癌癥治療中，青藤堿對(duì)腫瘤的抑制作用也已在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，它通過介導(dǎo)細(xì)胞增殖和凋亡來發(fā)揮作用[17]，如青藤堿抑制卵巢癌[18]細(xì)胞生長(zhǎng)能力，降低c-myc和Cyclin D1蛋白水平。青藤堿有極小的毒副作用，因此近年來青藤堿在抗腫瘤中的應(yīng)用越來越受到科研工作者們的重視。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，青藤堿可抑制786-O細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。青藤堿下調(diào)786-O細(xì)胞中c-myc的表達(dá)水平，而誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase 3表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果說明，青藤堿在腎癌細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤作用。

到目前為止，已有許多文獻(xiàn)報(bào)道了青藤堿抗腫瘤的能力。研究表明，5-氟尿嘧啶與青藤堿具有顯著的協(xié)同作用，與5-氟尿嘧啶相比，可以抑制LoVo細(xì)胞的生長(zhǎng)[19]。其他一些報(bào)告表明，青藤堿處理的A549與未處理的細(xì)胞相比，細(xì)胞數(shù)量減少。有研究者也指出青藤堿觸發(fā)時(shí)間依賴性的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致NCIH460的顯著損失細(xì)胞生存能力[20]。我們的研究也得出了類似的結(jié)論，與對(duì)照組相比，青藤堿處理后786-O細(xì)胞的抑制率明顯降低，且抑制率隨青藤堿濃度的增加而增加。青藤堿顯著下調(diào)c-myc蛋白表達(dá)，而誘導(dǎo)凋亡蛋白Bax、Caspase- 3表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果表明，青藤堿通過誘導(dǎo)786-O細(xì)胞周期G1/S期阻滯，促進(jìn)凋亡來提高對(duì)腎細(xì)胞癌的抑制作用。