響應面法優化刺梨多酚的超聲提取工藝及其抗氧化性研究

刺梨()是貴州省特有的藥食同源植物，野生種質資源十分豐富，民間常有生食、泡酒、糖漬等習慣。刺梨果實富含有機酸和十余種氨基酸、十余種對人體有益的微量元素、超氧化物歧化物和維生素C，具有較高的食用價值。研究表明，刺梨具有促進消化、抗氧化、抗癌防癌、調節機體免疫功能、解毒、鎮靜等藥理活性；刺梨果實中富含的植物多酚物質，作為天然植物源性抗氧化劑在預防和治療老年性退行性神經疾病、心臟保護、免疫系統促進、抗炎、皮膚保護等方面逐漸受到學者的關注。

超聲波輔助提取技術在天然產物活性物質提取上的應用廣泛，其獨有的空化效應和機械效應能增強提取中的傳質過程，從而提高提取率和縮短提取時間，具有高效、節能、不影響提取物結構和活性等優點。本研究通過單因素試驗討論乙醇體積分數、料液比、浸提溫度、浸提時間、超聲功率對刺梨多酚提取率的影響，在此基礎上根據Box-Benhnken中心組試驗設計原理進行三因素三水平的響應面分析試驗，以確定超聲輔助提取刺梨多酚的最佳工藝條件，為刺梨多酚的高效分離提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨果渣，貴州恒力源刺梨健康產業有限公司；無水乙醇，天津市富宇精細化工有限公司；沒食子酸標品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；福林酚，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；XAD-7型離子交換大孔吸附樹脂，德國Amberlite；DPPH自由基，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

A11 basic基礎型分析研磨機，德國IKA；標準檢驗篩，浙江上虞市道墟張興紗篩廠；SB-5200 DTD型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2800紫外可見分光光度計，美國UNICO；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；HH-S-4型恒溫水浴鍋，常州萬科儀器科技有限公司；RV 10型旋轉蒸發儀，德國IKA；FD-1D-50型冷凍干燥機，北京博醫康試驗儀器有限公司；Micro-ESR ACTIVE SPECTRUM；層析柱(Ф5cm×100cm)，上海華美實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 刺梨多酚的提取及分離純化 (1)刺梨多酚提取條件單因素試驗：將干燥刺梨果渣中的刺梨籽篩分出來，剩余的果渣用分析研磨機磨碎后過60目篩備用。刺梨多酚提取條件的單因素試驗：乙醇體積分數(40%、50%、60%、70%、80%)、料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)、浸提溫度(20、30、40、50、60℃)、浸提時間(10、20、30、40、50 min)、超聲功率(150、180、210、240、270 W)，抽濾后將濾液轉入100 mL容量瓶定容，吸取1.25 mL樣液于25 mL容量瓶中，按標準曲線制作方法測定吸光度，計算總酚含量。(2)沒食子酸標準曲線制作：Folin-Ciocalteus(FC)法：配置0、10、20、30、40、50 μg/mL的沒食子酸標準溶液，分別取上述不同濃度標準溶液0.5 mL加入1.0 mL FC試劑，5 min后加入2 mL NaCO(75 g/L)溶液，水浴50℃下保持5 min，室溫冷卻，用分光光度計測定溶液在740 nm處的吸光值。所得標準曲線為沒食子酸濃度C與吸光度值A的關系。

2.2.4 浸提時間對刺梨多酚提取率的影響 在乙醇體積分數60%、料液比1:20、浸提溫度40℃、超聲功率210 W的條件下，考察不同的浸提時間(10、20、30、40、50 min)對刺梨多酚提取率的影響，如圖1D所示，在浸提時間10～40 min之內，刺梨多酚的提取率隨浸提時間的延長從23.99 mg/g提高到32.30 mg/g，繼續延長浸提時間，提取率出現下降的趨勢，這可能是由于刺梨多酚在40 min后不再溶出，延長浸提時間會使溶出的多酚氧化分解，含量減少；其次可能是由于超聲的熱效應，長時間的超聲處理導致熱敏性組分的降解。

(1)

刺梨多酚提取率Y(%)=42.86+1.21A-1.22B+3.19C-1.65AB-0.7024AC+0.3632BC-1.44A-7.00B+0.2173C

模擬施工是項目信息管理BIM技術應用的突出優勢所在[2]。傳統信息管理模式下，不論是設計內容還是變更內容，其具體的質量信息需要通過建設實踐進行驗證，故而容易造成一定的材料損失和成本浪費。BIM技術應用下，基于建筑工程數字模型的存在，施工人員可進行前期的模擬施工操作。譬如，就管線施工而言，模擬施工的應用使得管線布局、管線碰撞等內容得以有效把控，然后在設計優化的同時，實現信息管理質量及工程建設質量的有效提升。

2.2.5 超聲功率對刺梨多酚提取率的影響 在乙醇體積分數60%、料液比1:20、浸提溫度40℃、浸提時間40 min的條件下，考察不同的微波功率(150、180、210、240、270 W)對刺梨多酚提取率的影響，如圖2E所示，在一定范圍內，刺梨多酚提取率隨超聲功率的增大而升高，可能是由于超聲波在提取溶液中產生的空化效應和機械作用使植物細胞壁破裂，促進有效成分的溶出，因此選擇270 W為超聲浸提功率。曹艷華等的研究中顯示，超聲功率對洋蔥多酚得率的影響顯著，在350 W時，洋蔥多酚提取率最大，繼續提高功率，提取率將下降。

1.3.2 響應面優化試驗設計 在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，選擇料液比、乙醇體積分數和浸提時間為自變量，刺梨多酚的提取率為響應值，作三因素三水平的響應面優化試驗(表1)。

1.3.3 刺梨多酚的抗氧化活性 (1)ESR參數條件：掃場范圍：3 380～3 540 G；微波功率：6 mW；模線圈振幅：3G；掃描次數：15次；掃描點數：4 096個。(2)不同濃度樣品溶液的測定：分別用10%、25%、40%、55%、70%體積分數的乙醇溶液將1.3.1(4)中制得的刺梨提取物配置并稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL質量濃度的樣液。取不同濃度的樣液50 μL，加入1 mL 0.5 mmol/L的DPPH溶液，混勻后避光靜置30 min，吸入直徑1 mm的毛細管，放入ESR振諧腔，記錄波譜圖并計算峰面積。用10%、25%、40%、55%、70%體積分數的乙醇溶液作空白對照。

CDFU可高效去除水中的油及懸浮物，保證兩級過濾器的進水水質，避免水質波動對兩級過濾器的沖擊，延長過濾器反洗時間，增加過濾器使用壽命;并且該裝置體積小，擺放靈活，滿足平臺空間限制要求，對海上油田有很強的適應性。

(2)

式(2)中，為空白對照的ESR波譜峰面積、為樣液的ESR波譜峰面積。

1.4 數據處理與統計分析

采用Microsoft Excel對進行數據整理，用IBM SPSS Statistics 25.0進行圖形繪制和顯著性分析，Design-Expert軟件進行響應面設計及優化分析。

胃鏡和結腸鏡檢查術可刺激患者咽喉、食管、胃及結直腸，從而導致交感神經過度興奮，主要表現為咽喉部痙攣、惡心、嘔吐、嗆咳、呃逆、躁動、疼痛、竇性心動過速及高血壓等應激反應[2]。胃腸鏡檢查，內臟痛是引起病人不適的主要原因，目前無痛胃腸鏡檢查臨床常用的μ受體激動劑復合丙泊酚，療效較好，但呼吸循環抑制發生率高。

2 結果與分析

2.1 刺梨多酚含量測定標準曲線的繪制

多酚測定標準曲線的回歸方程=0.019 6+0.003 6(=0.999 9)，該方程擬合度較好，可作為工作曲線表征提取液中刺梨多酚的沒食子酸當量。

2.2 單因素試驗分析

通過對我國養老政策、養老格局和養老服務現狀的分析，養老地產介入養老服務這一產業鏈條有兩條路徑可供選擇：

2.2.2 料液比對刺梨多酚提取率的影響 在乙醇體積分數60%、浸提溫度40℃、浸提時間30 min、超聲功率210 W的條件下，考察不同的料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)對刺梨多酚提取率的影響，如圖1B所示，在上述料液比范圍內，隨著料液比的增加，多酚提取率升高到32.71 mg/g，當料液比超過1:20時，繼續提高溶劑比例，多酚提取率不再升高且略有下降，可能是由于在料液比1∶20時，刺梨多酚基本已完全溶出，再增加溶劑的比例，相當于將已溶出的刺梨多酚稀釋，導致刺梨多酚濃度的降低，包善思等的研究中也出現了類似的規律和結果。

2.2.3 浸提溫度對刺梨多酚提取率的影響 在乙醇體積分數60%、料液比1:20、浸提時間30 min、超聲功率210 W的條件下，考察不同的浸提溫度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)對刺梨多酚提取率的影響，如圖1C所示，在20～60℃范圍內，刺梨多酚的提取率與浸提溫度呈正相關關系，在60℃時提取率達37.86 mg/g，可能是由于高溫增加提取物的溶解度和擴散系數，降低溶劑粘度，從而提高提取率，但是過高的溫度會引起酚類化合物的降解、內部氧化還原及聚合反應，同時易造成溶劑揮發，因此選擇60℃為浸提溫度較為合適。

(3)提取率的計算式(1)：

(4)刺梨多酚的分離純化：將1.3.1(1)中凍干的樣品配置成質量濃度5 g/L的樣液，用NaOH和HCL調pH到4，按流速1 mL/min上樣，直至樹脂飽和，分別用蒸餾水、10%、25%、40%、55%、70%體積分數乙醇溶液洗脫，洗脫流速1 mL/min，收集洗脫液，用旋轉蒸發儀將洗脫液中的乙醇蒸出，凍干得不同體積分數乙醇洗脫的刺梨多酚。

2.2.1 乙醇體積分數對刺梨多酚提取率的影響 在料液比1:20、浸提溫度40℃、浸提時間30 min、超聲功率210 W的條件下，考察不同的乙醇體積分數(40%、50%、60%、70%、80%)對刺梨多酚提取率的影響，如圖1A所示，乙醇體積分數在40%～80%范圍內，刺梨多酚提取率隨著乙醇體積分數的增加呈現出先升高后降低的趨勢，在乙醇體積分數50%時，提取率最大，達34.01 mg/g，李斌等在超聲輔助提取藍靛果多酚時也發現，乙醇體積分數50%時藍靛果多酚提取率達到最大，提取率隨乙醇體積分數的增大先增大后減小的原因可能與多酚的極性大小有關，另外乙醇濃度過高，在提取時易揮發，也會降低提取效果。

2.3 刺梨多酚的分離純化

用10%、25%、40%、55%、70%體積分數乙醇溶液對樹脂進行洗脫，將洗脫液中乙醇蒸出凍干后得到的不同體積分數乙醇洗脫的刺梨多酚，其純度分別為48.45%、81.24%、93.28%、75.30%、67.82%。

2.4 超聲輔助刺梨多酚提取工藝響應面優化試驗

2.4.1 響應模型的建立與分析 響應面分析法常用Box-Behbken設計在多因素系統中尋找最優條件，通過Design-Expert軟件對表2中數據進行二次回歸分析可得多元二次響應面回歸方程如式(3)：

式(1)中，為測量液總酚濃度(μg/mL)；為粗提液體積(mL)；為稀釋倍數；為原料質量(g)。

(3)

2012年黨的十八大以來，以習近平同志為核心的黨中央堅定不移地堅持高舉改革開放旗幟、推進全面深化改革、擴大對外開放的戰略決策部署，展現了黨中央將改革開放進行到底的政治魄力和堅定決心。

2.4.2 兩因素交互作用響應面分析 為了進一步探究各因素之間的交互作用，根據回歸方程繪出等高線圖和響應面。通過響應面的變化情況可直觀反映兩因素對刺梨多酚提取率的影響以及其對自變量的敏感程度，等高線形狀和稀疏程度可反映兩因素交互作用的強弱，扁圓形或馬鞍形則交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著。由圖2可以看出，乙醇體積分數50%時，刺梨多酚的提取率最高，乙醇體積分數和料液比對刺梨多酚提取率的影響較大，料液比曲面比乙醇體積分數曲面變化更陡峭，等高線更密集，說明刺梨多酚提取率對料液比的變化更敏感，與方差分析的結果相一致。

由圖3可以看出，乙醇體積分數50%時，刺梨多酚的提取率最高，浸提時間的曲面變化比乙醇體積分數的曲面變化更陡峭，等高線更密集，說明浸提時間比乙醇體積分數對刺梨多酚提取率的影響更顯著，其結果與方差分析的結果相一致。

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由圖4可以看出，料液比對刺梨多酚提取率的影響比浸提時間更顯著，料液比在1∶20時，刺梨多酚的提取率最高，浸提時間比料液比的等高線圖更密集和陡峭，說明浸提時間對刺梨多酚的提取率影響更顯著，與方差分析的結果相一致。

2.4.3 最佳提取條件的優化 用Design-Expret軟件對刺梨多酚提取率的回歸模型進行優化，選出超聲輔助提取刺梨多酚的最佳工藝條件為：乙醇體積分數42.784 5%、料液比1:23.810 g/mL、浸提溫度60℃、浸提時間44.113 min、微波功率270 W，預測在此條件下刺梨多酚的提取率為37.818 mg/g。考慮到實際情況和可操作性，故將該參數調整為乙醇體積分數43%、料液比1:24 g/mL、浸提溫度60℃、浸提時間45 min、微波功率270 W，在此條件下刺梨多酚的提取率為36.597 mg/g，與預測值接近，說明該模型優化的提取條件可靠。

習近平總書記指出：衛生與健康事業是一項極其崇高也非常特殊的事業。城市公立醫院需要在提高資源利用率、改善服務可及性和服務質量方面，發揮主導作用[14]。我院在開展醫務志愿者服務工作中，通過志愿助人服務、志愿關懷服務、志愿環衛服務為病人提供良好的就診體驗，有利于增加病人醫院就診意向，提高病人就診滿意度；醫護人員志愿公益義診，開展公益活動，有利于提高居民就醫可及性[15-16]和健康生活意識和行為；為社區居民提供與其醫療保險計劃相關聯的綜合性健康服務[17]，有利于提高服務質量與服務連續性[18]。

2.5 刺梨多酚的抗氧化活性

不同質量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)的樣液(10%、25%、40%、55%、70%體積分數乙醇溶液洗脫)和維生素C與DPPH自由基避光反應30 min后所測得的電子自旋共振波譜圖如圖5所示，隨著刺梨多酚和維生素C濃度的增加，ESR信號強度減弱，峰面積減小，這表示刺梨多酚清除DPPH自由基的能力增強，即抗氧化能力增強，雖然圖7A～F的空白曲線略有不同，但也能明顯看出，在質量濃度相同時，25%、40%、55%體積分數乙醇洗脫的刺梨多酚和維生素C比10%、70%體積分數乙醇洗脫的刺梨多酚清除DPPH自由基能力更強，即抗氧化性更強。

以峰面積表示DPPH自由基的濃度，由圖6可見，在一定范圍內，隨著刺梨多酚和維生素C濃度的增加，DPPH自由基清除率先急劇增加而后趨于平緩，且在質量濃度相同時，25%、40%、55%體積分數乙醇洗脫的刺梨多酚和維生素C比10%、70%體積分數乙醇洗脫的刺梨多酚的DPPH自由基清除率更高，即抗氧化性更強，與ESR圖譜結果一致；25%、40%、55%體積分數乙醇洗脫的刺梨多酚和維生素C的DPPH自由基清除率在0.8 mg/mL濃度即可達到100%，10%和70%體積分數乙醇洗脫的刺梨多酚僅能達77.63%和74.93%，再提高濃度到1.0 mg/mL時能達到83.87%和87.83%；由圖6、圖7可看出，不同體積分數乙醇洗脫的刺梨多酚對DPPH自由基的清除活性與其總酚純度存在一定的正相關關系，總酚純度越高，DPPH自由基的清除活性越強。總體來說，不同體積分數乙醇溶液洗脫的刺梨多酚的抗氧化能力依次為40%>25%>55%>10%和70%。

3 結論

本研究以刺梨果渣為研究對象，刺梨多酚的提取率為指標，在單因素試驗的基礎上，利用Box-Benhnken中心組試驗設計原理進行三因素三水平的響應面分析試驗，得到多元二次響應面回歸方程為：刺梨多酚提取率Y(%)=42.86+1.21A-1.22B+3.19C-1.65AB-0.7024AC+0.3632BC-1.44A-7.00B+0.2173C，各因素對刺梨多酚提取率的影響次序為：浸提時間>料液比>乙醇體積分數。經調整得到超聲輔助提取刺梨多酚的最佳工藝條件為乙醇體積分數43%、料液比1∶24 g/mL、浸提溫度60℃、浸提時間45 min、微波功率270 W，在此條件下刺梨多酚的提取率為36.597 mg/g，能達到模型預測值的96.77%。不同體積分數乙醇洗脫的刺梨多酚對DPPH自由基的清除活性與其總酚的純度存在一定的正相關關系，不同體積分數乙醇溶液洗脫的刺梨多酚的抗氧化能力依次為40%>25%>55%>10%和70%。