柱前衍生化高效液相色譜法分析大鼠體內D-絲氨酸和L-絲氨酸

型氨基酸主要位于哺乳動物的大腦皮層、海馬和外周組織中，被認為是重要的生物標志物。-絲氨酸(-Ser)是中樞神經系統中-甲基--天冬氨酸受體的重要內源性配體，由-絲氨酸(-Ser)經絲氨酸消旋酶轉化而來。-Ser是一種神經遞質，參與突觸傳遞、突觸可塑性等生理功能的調節，與-甲基--天冬氨酸受體功能障礙相關的神經系統疾病有密切關系，如阿爾茲海默癥、神經分裂癥、抑郁癥等。內源性-Ser水平的變化是當前神經生物學研究的熱點，因此研究并建立內源性-Ser高效靈敏的檢測方法對疾病預防和治療、臨床醫學、神經生物學研究等具有重大意義。

大多數氨基酸不具有紫外或熒光信號，氨基酸分析儀通過柱后衍生可一次性檢測多種氨基酸，但不能區分不同構型的氨基酸。生物體內的-Ser含量豐富，-Ser含量較低，且含有大量肽、胺類物質以及氨基酸，給-Ser的檢測帶來諸多干擾，目前常用的方法有毛細管電泳法、手性高效液相色譜法和酶分析方法，但這些方法均有缺點。本研究建立了以鄰苯二甲醛(OPA)和-乙酰--半胱氨酸(NAC)衍生化高效液相色譜分離紫外檢測的分析方法，具有操作簡單、價格低、靈敏度高、適用性好等優勢，可作為神經科學研究的有效技術和方法。此外，應用該方法測定了對照組和缺硒組大鼠血漿和腦組織中-Ser和-Ser含量，探究-Ser和-Ser與硒缺乏的關系，并可能為神經系統疾病的防治提供新的臨床診斷手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀、DAD紫外檢測器，美國安捷倫公司；BS210S電子天平，德國賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；DELTA 320 pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；多樣品組織研磨儀，上海賀帆儀器有限公司；OPA、NAC，上海麥克林生化科技有限公司；-Ser、-Ser，Sigma-Aldrich公司；甲醇，色譜級，Merck公司；硼砂、醋酸銨，天津市康科德科技有限公司。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標準溶液的配制 分別精密稱取-Ser、-Ser 各0.050 0 g，用超純水溶解并稀釋到50 mL，配制成1 mg/mL的儲備溶液。

1.2.2 衍生化試劑溶液的配制 分別精密稱取OPA 0.050 0 g、NAC 0.050 0 g，用5 mL甲醇溶解，加入20 mL 0.1 mol/L的硼砂緩沖液(pH 9.8)混合均勻，使用前配制。

從表6可見，綜合得分排在前4位的樣方依次是11、12、6和8號樣方。因為第一主成分代表多度，多度的方差貢獻率最大，因此11號、12號樣方以紫穗槐為優勢種的植被多度最多，生態重建性最好。而10、5、2號樣方分別以沙棘和白檸條為優勢種的植被多度最低，生態重建性最差。

1.3 方法

NAC-OPA衍生化法的一個缺點是衍生產物存在不穩定性，以峰面積評價穩定性發現，衍生化產物在30 ℃條件下4 h內穩定性良好。低溫可以延長衍生產物的穩定性，在4 ℃條件下12 h內穩定性良好。

1.3.4 液相色譜條件 色譜柱：Xbridge Amide column(250 mm × 4.6 mm，3.5 μm)；流動相：A：50 mmol/L醋酸銨，B：乙腈；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：340 nm；進樣量：10 μL；洗脫梯度見表1。

在上述衍生化條件和色譜條件下，-Ser 和-Ser得到很好地分離，如圖1所示，皮質樣品中-Ser和-Ser的分離度大于1.5，說明該色譜條件適合樣品中-Ser與-Ser含量分析。

1.3.2 樣品收集 實驗至第532天，缺硒組和對照組各取5只大鼠，眼靜脈叢取血0.5 mL，置于肝素鈉抗凝的離心管中，1 520×g條件下離心10 min，分離上清得到血漿；大鼠斷頭后迅速在冰盤上分離大腦皮質、海馬，將樣本于-80 ℃保存，用于后續-Ser和-Ser含量的測定。

2 結果與討論

2.1 系統適用性實驗

1.3.3 樣品處理與衍生化反應 (1)血漿：將360 μL甲醇加入到40 μL血漿中，渦旋5 min，8 100×g條件下離心10 min，取上清液350 μL在氮氣下吹干，加入70 μL新鮮配制的衍生化試劑，渦旋反應5 min后于8 100×g條件下離心5 min，取上清液10 μL進樣測定。(2)腦組織：精密稱取0.050 0 g腦組織，加入1 mL甲醇，冰浴條件下組織勻漿，勻漿液在8 100×g條件下離心10 min，取上清液400 μL氮氣下吹干，加入100 μL超純水渦旋反應5 min后于8 100×g條件下離心5 min，取上清液40 μL，加入40 μL新鮮配制的衍生化試劑，渦旋反應5 min后于8 100×g條件下離心5 min，取上清液10 μL進樣測定。

基于資源整合的農工商雙向流通電商模式研究..................................................................................................................................尹 超 張明玉（69）

冰浴條件下制備腦組織提取液，分別加入不同濃度水平的-Ser和-Ser的標準品，衍生化并離心分離后進樣測定。每個濃度3個樣本，計算方法回收率，結果見表2。方法回收率為97.29%～101.88%，相對標準偏差小于5.87%。

2.2 線性關系和定量下限

分別用儲備液配制-Ser和-Ser混合標準品溶液，即-Ser為 4、6、12、18、22、28 μg/mL系列標準溶液；-Ser為16、24、48、64、80、112 μg/mL系列標準溶液。分別取各標準溶液50 μL與等體積衍生化試劑衍生化后測定。以峰面積為縱坐標(Y)、標準品溶液的濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線。分別得到-Ser和-Ser的回歸方程為：Y=14.946X-18.496(=0.998 2)、Y=12.339X-44.555(=0.999 4)。結果表明，-Ser在2～14 μg/mL的范圍，-Ser在8～56 μg/mL范圍內具有良好的線性關系。以10倍信噪比計算定量限，-Ser和-Ser的定量限為0.04 μg/mL。

近年來還有研究提出，將右美托咪定等藥物作為神經阻滯的輔助用藥可顯著增長術后鎮痛時效，并降低術后阿片類藥物的用量[10]，但是需要權衡鎮痛時效延長與相關血流動力學副作用，在臨床上應審慎對待。

2.3 穩定性

1.3.1 動物實驗 3 w齡斷乳雄性Sprague-Dawley大鼠10只，體重(48.3±5.9)g，采購于三峽大學實驗動物中心，生產許可證號為SCXK(鄂)2017-0012。將大鼠分為缺硒組(SD組，=5)、對照組(SS組，=5)，缺硒組飼喂低硒飼糧(含0.02 mg Se/kg飼糧)，正常組飼喂正常飼糧(含0.18 mg Se/kg飼糧)。低硒飼糧按照AIN-93標準配制，正常飼糧是在低硒飼糧的基礎上添加亞硒酸鈉制成。大鼠飼養環境溫度為(20±2)℃，相對濕度為55%～65%，自由飲食。

開學第二天清晨，高三全體學生在操場上集合宣誓。黎明前的空中，還殘留著一些凜冽的夜色，但天空慢慢就被紅光占領，太陽就要升起了。

2.4 回收率

(3)政府激勵政策有效，相應的政策法規出臺和宣傳所花費的成本為C1；政府激勵政策有效，購房者響應政府號召，積極購買和使用被動房，政府對這些購房者進行獎勵所花費的成本C2，購房者購買被動房的額外增量成本C3。

2.5 精密度

冰浴條件下制備腦組織提取液，分別加入240 μg/mL的-Ser和60 μg/mL的-Ser的標準品10 μL，加入50 μL衍生化試劑，渦旋反應5 min后8100×g離心5 min，取上清液置于液相小瓶中，進樣檢測峰面積。重復衍生化反應及后續步驟，測定6次，計算得到峰面積的RSD值為1.63%和1.83%，表明精密度良好。

2.6 方法學應用

用上述建立的方法檢測對照組和缺硒組大鼠血漿、大腦皮質和海馬組織中-Ser和-Ser含量。結果如圖2所示，與對照組相比，缺硒組大腦皮質和海馬中-Ser和-Ser含量無明顯差異，血漿中-Ser含量顯著升高(<0.05)，-Ser含量無顯著變化。血漿中-Ser含量有可能與硒缺乏有關。

3 結論

本研究建立了NAC-OPA柱前衍生化法反相液相色譜紫外檢測測定大鼠血漿和腦組織中-Ser和-Ser的方法，該方法快速、靈敏、專屬性好、檢測時間短、應用范圍廣。經方法學驗證該方法的精密度、穩定性、線性關系、加樣回收率均良好，適用于動物血漿和腦組織中-Ser和-Ser的同時檢測，為硒缺乏與神經系統疾病的進一步研究提供方法學參考。