鮮乳中抗生素殘留微生物檢測技術研究

胡燕玲，陳亞波

（中山市食品藥品檢驗所，廣東中山 528400）

鮮乳由于營養豐富被稱為“白色血液”，是人們尤其是嬰幼兒的主要營養品，對鮮乳安全問題影響最大的是抗生素殘留。隨著夏行昊[1]、李惠[2]、王宏博[3]和陶利明等[4]對牛奶及乳制品中抗生素殘留危害相關問題的研究報道，近些年多個省市（浙江省、遼寧省、廣州市、昆明市、貴陽市和烏魯木齊市等）[5-10]對鮮乳及奶類食品中的抗生素殘留進行檢測，結果發現不同批次的奶類食品中均有檢出抗生素殘留陽性。鮮乳及其乳制品中抗生素殘留問題日益受到關注。目前，鮮乳中抗生素殘留的檢測方法有儀器法[11-13]、免疫法[14-16]、和微生物學法[17-19]。這3種方法中，儀器法需要有大型儀器設備，并且檢測程序復雜、檢測費用較高；免疫法在檢測過程中很容易受外界因素的影響，適合實驗室樣品量少的研究實驗；微生物檢測方法不需要大型儀器、操作簡單和成本低廉，是目前實驗室、牧場和企業中應用較廣泛的方法[20]。

本文通過采用利普斯50（E50）試劑盒快速檢測與國家標準GB/T 4789.27—2008[21]微生物法進行檢測比對，建立起完善的鮮乳中抗生素殘留檢測技術。有利于加強廣東省中山市乳制品的監管，杜絕有抗奶流入市場，保證乳及乳制品的質量安全，減少經濟損失和人身傷害。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

利普斯50（E50）抗生素檢測試劑盒、4% 2,3,5-氯化三苯四氮唑（TTC）水溶液、溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培養基、青霉素G鉀鹽、磷酸鹽緩沖液（PBS）等均購于北京陸橋；無抗生素的脫脂乳購于超市。

1.2 儀器與設備

HVA-85高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司）；KB400生化培養箱[賓德亞太（香港）有限公司]；LSC-316C冰箱（浙江星星家電股份有限公司）；帶蓋恒溫水浴鍋；JY20002電子天平；10～100 μL微量移液器（德國普蘭德公司）；QL-861旋渦混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；L400離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

1.3 標準菌株

嗜熱鏈球菌（IFFI 6038）和嗜熱脂肪芽胞桿菌卡利德變種（GIM1.543）購自廣東省微生物菌種儲藏中心。

1.4 嗜熱鏈球菌菌液的配制

挑取新鮮培養物嗜熱鏈球菌接種無菌脫脂乳，按照GB/T 4789.27—2008[21]中第6.2條規定配制測試菌液。注意嗜熱鏈球菌如果是超低溫冰箱保存，要先肉湯復蘇后劃營養瓊脂純化確定活性后才能用于實驗。

1.5 嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞懸液及測試培養基的配制

按照GB/T 4789.27—2008第12.1和12.2條規定配制嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞懸液及測試培養基的制備。配制過程中需要注意以下幾點：嗜熱脂肪芽胞桿菌需在營養瓊脂平板上反復純化兩次，挑取新鮮培養的單個菌落劃營養瓊脂平板與（36±6）℃培養3～ 4 d；嗜熱脂肪芽胞桿菌的芽胞要經鏡檢高達95%以上才能進行芽胞懸浮液的配制；測試培養基分裝小管時，做好小管口密封防止水分蒸發；涉及標準菌株操作要遵循實驗室生物安全制度，在二級生物實驗室安全柜里操作。

1.6 加標檢測乳液制備

在精確度為0.000 1 g天平上稱取青霉素G鉀鹽標準品10.0 mg，先用適量無菌磷酸鹽緩沖液溶解，再將該溶液用無菌的無抗生素的脫脂奶稀釋，取含青霉素G鉀鹽標準品濃度為1 μg·mL-1，0.1 μg·mL-1，0.008 μg·mL-1，0.006 μg·mL-1，0.005 μg·mL-1， 0.004 μg·mL-1，0.003 μg·mL-1。

1.7 實驗原理與檢測

1.7.1 利普斯50（E50）抗生素檢測試劑盒原理與檢測

（1）原理。利普斯50的檢測基于細菌生長抑制的原理。當微孔板放置于65 ℃恒溫培養箱培養時，孢子萌發，細菌生長并代謝產生酸使得瓊脂的酸堿度降低，從而導致瓊脂中酸堿指示劑由藍色（紫色）變為微黃色。如果待檢的乳樣品中含有高于檢出限的抗生素殘留，則微生物生長被抑制，瓊脂中的顏色不發生變化。

（2）檢測。取出實驗所需要的微孔板，垂直撕開微孔板上保護箔膜，每孔加入50 μg·mL-1樣品，每個樣品做三孔平行檢測，同時作陰性和陽性對照。用黏性膠膜封好板孔，放置于65 ℃恒溫培養箱培養2.75 h。觀察時從微孔側面觀察檢測結果，以標準比色卡為參照，顯藍色為陽性，顯黃色為陰性，非藍非黃的為可疑結果，需進行復檢。

1.7.2 嗜熱鏈球菌抑制法（傳統TTC法）原理與檢測

（1）原理。按照GB/T 4789.27—2008第2條規定，待測試樣品經過80 ℃殺菌后，加入預先制備的嗜熱鏈球菌液。36 ℃培養2 h后，嗜熱鏈球菌開始增長繁殖。加入代謝底物4% 2,3,5-氯化三苯四氮唑（TTC）水溶液顯色劑，若該樣品中不含有抗生素或抗生素的濃度低于檢測限，嗜熱鏈球菌繼續增殖，反應還原TTC成為紅色物質。反之，若樣品中含有高于檢測限的抑制劑，則嗜熱鏈球菌生長受抑制，TTC不發生還原反應，樣品保持原來顏色不變。

（2）檢 測。按 照GB/T 4789.27—2008第6.3條的標準方法進行實驗操作，并做陰陽性對照實驗，同時注意加入測試液及TTC顯色劑時要輕搖或渦旋15 s混勻，所有實驗管放置在36 ℃水浴避光培養 30 min，立即觀察其顏色變化。若顏色無變化，于水浴中繼續避光培養30 min進行最終觀察。觀察時要快速，最好關燈觀察，避免光照過久干擾。TTC指示劑配制一定要避光，實驗過程中也要避光操作，盡量減少假陽性的結果。

結果觀察與判讀：在白色背景前觀察，試管中樣品呈乳的原色時，表示指示乳中有抗生素存在，結果為陽性。若試管中樣品呈紅色，則為陰性。如試管顏色變化無法判定，則為可疑結果，需重新檢測。

1.7.3 嗜熱脂肪芽胞菌抑制法原理與檢測

（1）原理。培養基預先混合嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞，并含有pH指示劑（溴甲酚紫）。加入樣品并孵育后，若該樣品中不含有抗生素或抗生素的濃度低于檢測限，細菌芽胞將在培養基中生長并利用糖產酸，pH指示劑由紫色變為黃色。反之，如果樣品中含有高于檢測限的抗生素，則細菌芽胞不會生長，pH指示劑的顏色保持不變，仍為紫色。

（2）檢測。按照GB/T 4789.27—2008第12.3條的標準要求進行實驗操作，注意同時做陰陽性對照實驗，實驗管置于（65±2）℃水浴培養2.5 h，觀察培養基的變化。若實驗管顏色沒有變化，需在水浴中培養30 min再進行最終觀察。

結果判讀：在白色背景前從側面和底部觀察小試管內培養基顏色。培養基顏色為紫色判讀為陽性結果，培養基變成黃色或黃綠色判讀為陰性結果，顏色處于二者之間，則為可疑結果。出現可疑結果應繼續培養30 min再進行最終觀察。若培養基顏色仍然處于黃色和紫色之間，仍為可疑結果，表示抗生素濃度接近方法的最低檢出限，需重新檢測。

2 結果與分析

2.1 三種檢測方法加標測試所取得的結果

利普斯50（E50）、嗜熱鏈球菌抑制法（傳統TTC法）和嗜熱脂肪芽胞菌抑制法檢測加標乳液抗生素殘留的檢測結果如表1所示。利普斯50（E50）、嗜熱鏈球菌抑制法（傳統TTC法）和嗜熱脂肪芽胞菌抑制法在鮮乳中抗生素殘留檢測結果一致。

表1 3種檢測方法加標測試所取得的結果比較

2.2 實際樣品檢測

通過從市面上隨機購買61批牛奶樣品，其中低溫保存鮮牛奶10批，散裝水牛奶4批，乳粉2批（按照奶粉說明用無菌水配制后進行檢測），常溫保存純牛奶45批。分別采用利普斯50（E50）試劑盒、國標嗜熱鏈球菌抑制法（傳統TTC法）和嗜熱脂肪芽胞菌抑制法進行檢測，試驗結果表明61批牛奶樣品的抗生素殘留檢測結果均為陰性，說明市面上銷售的牛奶及奶制品中抗生素殘留是比較安全的。

3 結論

實驗結果表明，采用利普斯50（E50）法得到的檢測結果與國家標準GB/T 4789.27—2008中嗜熱鏈球菌抑制法（傳統TTC法）和嗜熱脂肪芽胞菌抑制法一致。國家標準嗜熱鏈球菌抑制法（傳統TTC法）只適用于鮮乳檢測，試管顏色變化很容易判讀為假陽性；嗜熱脂肪芽胞菌抑制法雖然適用于鮮乳、復原乳、消毒滅菌乳和乳粉中抗生素檢測，但是實驗前標準菌株的優質保存、活化、測試菌液制備、芽孢懸液制備及測試培養基制備等耗時長，對檢驗人員技術熟練度要求較高。利普斯50（E50）方法適合鮮乳及乳制品中抗生素殘留的檢測，其操作步驟簡單方便，2.75 h出結果，檢測量大，快速高效，一般檢驗員都能進行檢驗操作，可作為鮮乳中抗生素殘留檢測首選快速檢測法，值得在奶牛養殖場、鮮乳制品企業和檢驗機構中推廣應用。