毛柳苷在腦缺血再灌注后抑制神經元自噬及神經保護作用研究

溫少紅，劉寬，趙順英，董雯，陳青芳，陳文濤，葉維貞，姜鳴鈺，劉向榮

卒中是世界范圍內導致人類死亡和殘疾的主要疾病之一，其中缺血性卒中占卒中總數的87%，嚴重威脅著人類的健康，同時也大大增加了醫療保健的社會經濟負擔[1-2]。時間窗內溶栓是目前最有效的缺血性卒中再灌注治療方法，但是溶栓治療的時間窗窄且有出血轉化的風險，限制了其應用[3]，尋找新的缺血性卒中治療靶點和藥物是目前的研究熱點。

紅景天作為傳統植物藥，已被廣泛用于預防和治療疲勞、疼痛、阿爾茨海默病、抑郁和焦慮等常見疾病[4]。毛柳苷（salidroside，SAL）是從紅景天中提取的一種苯丙素苷，是紅景天的主要生物活性成分，具有抗炎、抗凋亡、抗缺氧、抗抑郁、抗氧化應激等多種藥理作用[5-6]。自噬是一種自我吞噬的細胞分解代謝途徑，通過降解和回收長壽命的蛋白質、受損的細胞器和錯誤折疊的蛋白質，維持細胞內穩態和正常的細胞功能[7-8]。近年來研究發現自噬在缺血性卒中中發揮著重要作用[9-12]。本研究旨在探索SAL是否通過調節神經元自噬在腦缺血再灌注損傷中發揮神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物及配制 本研究藥物SAL（Sigma-43866，美國），規格25 mg，其分子式為C14H20O7，分子量為300.30。將一支SAL溶于1.25 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），在無菌環境中采用0.22 μm一次性針頭式濾器（Millipore，美國）過濾溶解的藥液以除菌，該貯存液濃度為20 mg/mL（摩爾濃度66.6 mmol/L）。體內研究中，小鼠的給藥劑量為10 mg/kg，小鼠體重22±0.5 g，每只小鼠實際給藥量為0.22 mg，每只小鼠給藥體積為150 μL（139 μL PBS+11 μL貯存液，臨用前現配）。體外研究中，大鼠原代神經元的給藥劑量為50 μmol/L，給藥時每毫升細胞培養液中加SAL貯存液0.75 μL。大鼠原代神經元接種于10 cm細胞培養皿（Corning，美國），接種量為6×105個/皿，每皿細胞實際給藥量為0.12 mg。

1.2 體內研究

1.2.1 實驗動物 選取8～10周C57BL/6J雄性小鼠36只（購于北京華阜康生物科技股份有限公司）。本實驗遵照北京市神經外科研究所實驗動物福利倫理委員會要求進行（動物倫理批號：201902039），實驗小鼠采用標準飼料和純凈水分籠飼養，飼養溫度22～24 ℃，相對濕度50%～60%，12 h循環照明。

1.2.2 腦缺血再灌注模型制作與給藥 小鼠稱體重后，隨機分為假手術組（12只）、溶劑組（12只）和SAL組（12只）。異氟烷（瑞沃德，中國）麻醉小鼠，分離右側頸總及頸內外動脈，線栓法制作右側大腦中動脈閉塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO），線栓（Doccol-602156PK5Re，外徑0.21 mm、硅膠包被長度5～6 mm，美國）自頸外動脈插入，插栓缺血1 h后，拔栓實現再灌注，即刻尾靜脈注射150 μL SAL（SAL組）或同體積PBS（溶劑組）進行再灌注。假手術組只分離血管不插栓且不給藥。術中通過激光多普勒血流儀（瑞沃德，中國）監測腦血流判斷模型是否成功，體溫維持儀維持小鼠術中肛溫37±0.5 ℃。

1.2.3 神經功能缺損評分 缺血再灌注后24 h盲法對小鼠進行神經功能缺損評分[13]。運動功能缺損評分：①提起小鼠尾巴，正常為0分，前肢或后肢彎曲為1分，頭部在30 s內向垂直軸方向移動＞10°為1分，最高3分；②將小鼠放在地板上，正常行走為0分，不能直線行走為1分，身體向患側傾斜為2分，身體倒向患側為3分。感覺功能缺損評分：①采用尖銳的針尖觸摸小鼠前爪掌區測評其觸覺反應，正常為0分，反應遲緩為1分，無反應為2分；②用棉簽壓住小鼠一側頸部來評估本體感受反應，正常為0分，反應遲緩為1分，無反應為2分。神經功能缺損評分總分為10分，分值越高，小鼠的神經功能缺損越嚴重。

1.2.4 腦梗死率測定 缺血再灌注后24 h且神經功能缺損評分結束后，處死小鼠并取每組12只小鼠全腦進行冰凍切片。從前至后每隔1 mm選取20 μm厚的一片切片，使用神經元特異核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）抗體（Millipore-ABN78，美國，1∶600）染色，共標記7個層面的神經元。通過Vectra Polaris全自動成像系統（Perkin-Elmer，美國）拍攝熒光圖片，并采用ImageJ軟件對熒光圖片進行數據分析。患側每層神經元損傷體積=患側神經元損傷面積×層厚，患側神經元總損傷體積為每層神經元損傷體積之和；健側每層神經元體積=健側神經元面積×層厚，健側神經元總體積為健側每層神經元體積之和；小鼠腦梗死率=（患側神經元總損傷體積/健側神經元總體積）×100%（左側大腦為健側，右側大腦為患側）。

1.2.5 免疫組織熒光染色 選取制備的小鼠全腦冰凍切片進行免疫組織熒光染色，切片依次進行破膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）封片。①選取溶劑組小鼠全腦冰凍切片，將自噬標記物微管相關蛋白1輕鏈3B（microtubule associated protein 1 light chain 3 beta，LC3B）（CST-83506，美國，1∶500）分別與NeuN（Millipore-ABN78，美國，1∶600）、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（abcamab68428，美國，1∶500）免疫熒光共染并標記梗死周邊區神經元、星形膠質細胞。使用激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss AG，德國）觀察LC3B與神經元、星形膠質細胞共定位情況，以明確缺血再灌注后24 h產生自噬活動的主要部位。②每組選取3只小鼠全腦冰凍切片，將其他自噬標記物Beclin-1（CST-3495，美國，1∶200）、自噬相關蛋白3（autophagy related protein 3，Atg3）（CST-3415，美國，1∶200）分別與NeuN（Millipore-MAB377，美國，1∶600）免疫熒光共染，使用激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss AG，德國）觀察，使用ImageJ軟件分別對Beclin-1+/NeuN+細胞、Atg3+/NeuN+細胞計數。

1.3 體外研究

1.3.1 大鼠原代神經元提取及培養 大鼠原代神經元取自胎齡18 d SD胎鼠大腦皮層。將腦組織表面的腦膜和血管剔除后，碾碎腦組織并用胰酶消化。隨后將神經元以6×105個/皿的密度接種在裝有神經元基礎培養基（Gibco，美國）的直徑10 cm細胞培養皿中，并添加2%無血清添加劑（B-27 supplement，B27）、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素/鏈霉素雙抗（Gibco，美國），培養基及以上添加物終體積為8毫升/皿。每3天進行一次半量換液，連續培養至第10天，用于后續研究。

1.3.2 大鼠原代神經元氧糖剝奪 神經元培養至第10天，進行氧糖剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）。細胞分為6組：①對照（control，CON）組，②氧糖剝奪1 h后復氧1 h（OGD 1 h）組，③氧糖剝奪1 h后復氧4 h（OGD 4 h）組，④SAL組，⑤氧糖剝奪1 h后復氧1 h/全程SAL治療（OGD+SAL 1 h）組，⑥氧糖剝奪1 h后復氧4 h/全程SAL治療（OGD+SAL 4 h）組。

OGD具體流程如下：超凈工作臺（ESCO，新加坡）內，無菌PBS清洗神經元2次以去除培養基中的葡萄糖，隨后更換為無添加葡萄糖的達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）（Gibco，美國）；將神經元放置于缺氧小室（Stemcell，美國），95%N2/5%CO2通入小室內以排盡氧氣，平衡5 min后密封缺氧小室，將小室置于細胞培養箱內，1 h后取出神經元復氧，更換為原神經元基礎培養基1 h或4 h后收集細胞。CON組和SAL組不進行OGD，其中SAL組在培養皿中加入50 μmmol/L SAL（即6微升/皿SAL貯存液）處理，加藥4 h后收集細胞，CON組也在4 h后收集細胞；其余組進行OGD，OGD+SAL 1 h組和OGD+SAL 4 h組分別在OGD時、復氧后加入與SAL組同等劑量SAL處理，OGD 1 h組和OGD+SAL 1 h組復氧1 h后收集細胞，OGD 4 h組和OGD+SAL 4 h組復氧4 h后收集細胞。體外實驗流程見圖1。

圖1 大鼠原代神經元氧糖剝奪流程圖

1.3.3 免疫印跡試驗 裂解“1.3.2 大鼠原代神經元氧糖剝奪”中收集的細胞，12 000轉/分離心20 min，取上清液經BCA蛋白檢測試劑盒（Pierce，美國）定量后依次進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白轉膜、膜的封閉、一抗孵育（LC3B、Beclin-1、Atg3、Atg5、Atg7）、二抗孵育、發光液顯影，通過G：BOX化學發光成像系統（Syngene，英國）檢測蛋白條帶，使用ImageJ軟件分析圖像并計算目標蛋白相對表達量。免疫印跡所用一抗分別為LC3B（CST-3868，美國，1∶1000）、Beclin-1（CST-3495，美國，1∶1000）、Atg3（CST-3415，美國，1∶1000）、Atg5（CST-12994，美國，1∶1000）、Atg7（CST-8558，美國，1∶1000），酶標二抗抗兔IgG（CST-7074，美國，1∶2000）。同時在同一膜上測定肌動蛋白（Santa Cruz-1616，美國，1∶500）的表達，將其作為內參。細胞實驗均重復3次。

1.3.4 大鼠原代神經元免疫熒光染色 CON組、OGD 4 h組細胞固定后LC3B（CST-83506，美國，1∶500）與NeuN（Millipore-ABN78，美國，1∶600）免疫熒光共染，采用EVOSTM FL Auto 2成像系統（Life technology，美國）觀察神經元自噬水平，使用ImageJ軟件對LC3B+/NeuN+細胞計數。

1.4 統計方法 采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行統計分析，計量資料符合正態分布，以表示；多組比較采用單因素方差分析，在整體差異有統計學意義的情況下進行Tukey檢驗進行兩兩比較；兩組比較采用獨立樣本t檢驗；P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 體內研究結果

2.1.1 SAL對缺血再灌注小鼠的神經保護作用 缺血再灌注后24 h，假手術組、溶劑組、SAL組小鼠間神經功能缺損評分的整體差異有統計學意義。兩兩比較顯示，溶劑組和SAL組神經功能缺損評分均高于假手術組（均P＜0.0001）；SAL組神經功能缺損評分低于溶劑組（P=0.0332）。缺血再灌注后24 h，3組間腦梗死率比較差異有統計學意義。兩兩比較顯示，溶劑組和SAL組腦梗死率均高于假手術組（均P＜0.0001）；SAL組腦梗死率低于溶劑組（P=0.0038）（表1，圖2）。

圖2 毛柳苷對缺血再灌注小鼠的神經保護作用

表1 缺血再灌注后24 h小鼠神經功能缺損評分及腦梗死率結果

2.1.2 LC3B與缺血再灌注小鼠梗死周邊區神經元、星形膠質細胞共定位情況 缺血再灌注后24 h，溶劑組小鼠LC3B與神經元有共定位（圖3A～B），與星形膠質細胞無共定位（圖3C～D）。即缺血再灌注后24 h，小鼠梗死周邊區神經元表達自噬標記物LC3B，然而梗死周邊區星形膠質細胞此時并未表達LC3B。

圖3 LC3B與缺血再灌注小鼠梗死周邊區神經元、星形膠質細胞共定位情況

2.1.3 Beclin-1、Atg3與缺血再灌注小鼠梗死周邊區神經元共染結果 缺血再灌注后24 h，假手術組、溶劑組和SAL組3組間單位面積（1 mm2）內Beclin-1+/NeuN+、Atg3+/NeuN+細胞個數比較差異均有統計學意義。兩兩比較顯示，與假手術組相比，溶劑組Beclin-1+/NeuN+、溶劑組Atg3+/NeuN+、SAL組Atg3+/NeuN+單位面積內細胞個數均增多（P=0.0010，P＜0.0001，P=0.0005）；與溶劑組相比，SAL組Beclin-1+/NeuN+、Atg3+/NeuN+單位面積內細胞個數減少（P=0.0121，P=0.0013）（表2）。圖4為Beclin-1、Atg3與NeuN共染免疫熒光代表圖。

圖4 自噬相關蛋白Beclin-1、Atg3與腦缺血再灌注小鼠梗死周邊區神經元共染結果

表2 缺血再灌注后24 h小鼠梗死周邊區Beclin-1+/NeuN+、Atg3+/NeuN+細胞計數結果[單位：個/平方毫米]

2.2 體外研究結果

2.2.1 SAL對氧糖剝奪大鼠原代神經元自噬相關蛋白相對表達量的影響 6組間比較，LC3B、Beclin-1、Atg3的相對表達量整體差異有統計學意義，Atg5和Atg7的相對表達量整體差異無統計學意義。兩兩比較顯示，與CON組相比，OGD 1 h組、OGD 4 h組LC3B相對表達量升高（P=0.0174、P＜0.0001）；與OGD 1 h組相比，OGD 4 h組LC3B相對表達量升高（P=0.0038），SAL組LC3B相對表達量降低（P=0.0476）；與OGD 4 h組相比，SAL、OGD+SAL 1 h組LC3B相對表達量降低（P＜0.0001，P=0.0002）；OGD+SAL 4 h組與CON組、OGD 1 h組、OGD 4 h組、SAL組、OGD+SAL 1 h組相比，LC3B相對表達量降低（P=0.0002，P＜0.0001，P＜0.0001，P＜0.0001，P＜0.0001）。OGD+SAL 1 h組Be cl i n-1相對表達量低于OGD 4 h組（P=0.0458）；OGD+SAL 4 h組Beclin-1相對表達量低于CON組、OGD 1 h組、OGD 4 h組、SAL組、OGD+SAL 1 h組（P=0.0005，P＜0.0001，P＜0.0001，P=0.0002，P=0.0030）。OGD+SAL 4 h組Atg3相對表達量低于OGD 1 h組和OGD 4 h組（P=0.0119，P=0.0211）（表3，圖5）。

圖5 自噬相關蛋白LC3B、Beclin-1、Atg3、Atg5、Atg7免疫印跡代表性條帶

表3 SAL對氧糖剝奪大鼠原代神經元自噬相關蛋白相對表達量的影響

2.2.2 大鼠原代神經元自噬標記物LC3B免疫熒光染色結果 CON組神經元在單位面積（1 mm2）的LC3B+/NeuN+細胞個數為51.9±18.7個，OGD 4 h組為584.2±34.5個，2組之間差異有統計學意義（P=0.0002）（圖6）。

圖6 大鼠原代神經元自噬標記物LC3B免疫熒光染色結果

3 討論

自噬作為維持真核生物中與受損細胞器形成和降解相關的細胞蛋白平衡的重要機制，越來越多的證據表明，缺血性卒中激活了各種類型的大腦細胞的自噬，如神經元、膠質細胞和大腦微血管細胞等[14]，這可能為缺血性卒中的臨床治療提供了潛在的靶點。然而，自噬在缺血性腦損傷中發揮保護還是損傷作用仍存在爭議。一般認為在神經元系統中，適度的自噬具有神經保護作用，因為自噬有助于清除與神經變性相關的聚集蛋白；不充分或有缺陷的自噬則可能導致神經元死亡；而過度的自噬通常由強烈的壓力觸發，也可促進神經元死亡[15-16]。自噬的程度和其被誘導的時間點可能才是真正決定自噬對缺血再灌注后神經元歸轉作用的關鍵因素[17]。

目前已證實哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、Beclin-1/B淋巴細胞瘤-2（Beclin-1/B-cell lymphoma-2，Beclin-1/Bcl-2）等多種信號通路在自噬活動中發揮了調節作用[18-20]。其中自噬相關蛋白Atg3、Atg5、Atg7在自噬中發揮核心調控作用：Atg3可以作為E2泛素樣偶聯酶，促進吞噬體伸長[21]；Atg5是自噬小泡形成不可或缺的蛋白，敲除ATG5基因可導致自噬下調或完全抑制[22]；Atg7是一種重要的自噬效應酶，與其他Atg蛋白協同調節免疫、細胞死亡和蛋白分泌，可以獨立調控細胞周期和凋亡[23]。LC3即微管相關蛋白1A/1B-輕鏈3（microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3，MAP1LC3，簡寫LC3），它包括LC3A、LC3B、LC3C等3種亞型，其中LC3B與自噬小體的發育成熟有關，常用于監測自噬活性[24]。自噬發生時，胞漿型LC3BⅡ會酶解掉一小段多肽，轉變為自噬體膜型LC3BⅡ，LC3BⅡ含量增加代表自噬被激活，LC3BⅡ含量降低則代表自噬被抑制，通常采用LC3BⅡ/LC3BⅠ比值評估自噬水平的高低。此外，Beclin-1可以干預自噬通路從自噬小體形成到自噬小體/核內體成熟的每一個主要步驟，亦常作為自噬形成的標志物之一[25]。

在本次體內外研究中SAL的劑量（小鼠10 mg/kg，大鼠原代神經元50 μmol/L）參考了本課題前期研究結果[26]。體內實驗結果顯示，SAL具有明確的腦缺血再灌注損傷保護作用，可以顯著改善腦缺血再灌注小鼠感覺運動神經功能，降低腦梗死率。對腦缺血小鼠進行LC3B、NeuN的免疫熒光染色結果亦證實了腦缺血急性期梗死周邊區神經元發生了自噬，而SAL治療可以降低神經元自噬水平（SAL組單位面積內Beclin-1+/NeuN+、Atg3+/NeuN+細胞數量下降）。在大鼠原代神經元的OGD研究中，觀察到OGD后神經元發生了明顯的自噬（OGD 1 h、OGD 4 h后LC3B表達量顯著高于CON組），給予OGD神經元SAL處理后，自噬相關蛋白Beclin-1、Atg3、LC3B的表達水平均顯著下降，而Atg5、Atg7在此時的表達水平雖然未出現統計學差異，但存在下調趨勢。以上結果提示SAL治療可能通過抑制神經元自噬水平發揮神經保護作用，SAL可以作為缺血性卒中臨床治療的潛在藥物，具有十分廣闊的應用前景。然而SAL干預神經元自噬水平的具體分子機制仍有待進一步研究，這也是本研究的局限性之一。

【點睛】毛柳苷通過下調自噬相關蛋白表達，抑制神經元自噬，在腦缺血再灌注損傷中發揮神經保護作用。