載銅綠假單胞菌OprF和PcrV基因聯合DNA疫苗的水凝膠緩釋系統的構建及免疫效力評價

趙軒，江曉烽，秦江雷，王勇，石敏，雍琴，余嫻*

1重慶醫科大學附屬第二醫院Ⅰ期臨床試驗研究室，重慶 400010；2河北省炎癥自身免疫性疾病發病機制與控制重點實驗室，河北保定 071002

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)在自然界中分布廣泛，可感染多種宿主[1]，尤其是可引起人類呼吸道、燒傷傷口等感染，嚴重者可危及患者生命[2]。PA由于其高耐藥性和基因多樣性[3]，臨床防治具有一定的挑戰性。早在2017年，WHO就將耐碳青霉烯類PA列入細菌病原體的關鍵類別[4]。鑒于有效抗菌藥物的缺乏，亟需研發一種行之有效的PA疫苗來解決這一困境。相較于滅活疫苗、減毒活疫苗等傳統疫苗，DNA疫苗具有易生產、成本低、穩定性高和不存在毒力逆轉風險等優勢[5]。近年來研究發現，PA外膜蛋白F(outer membrane protein F，OprF)免疫原性強，在不同菌株中高度保守，參與了PA生物膜的形成，與PA耐藥及定植相關，是PA疫苗研發的熱門候選抗原之一[6-7]。此外，位于PA Ⅲ型分泌系統尖端的V抗原(Pseudomonas V antigen，PcrV)是該系統的主要轉運蛋白，起著“開關”的作用，是決定毒素分泌啟動的關鍵，其編碼基因在不同PA菌株中高度保守[8]，具有良好的免疫原性，是一種很有前景的疫苗候選抗原[9-11]。本課題組前期研究發現，聚天冬氨酸酰肼/聚乙二醇二醛[poly(aspar tic acid) derivatives with hydrazide functional groups/poly(ethylene glycol) dialdehyde，PAEH/PEG DA]水凝膠易于制備，且具有良好的穩定性、安全性及緩釋作用等優點[12]，可進一步用于體內DNA疫苗的遞送。本研究在前期研制載PA OprF DNA疫苗溫敏水凝膠系統[13]的基礎上，研制了OprF和PcrV基因聯合DNA疫苗，希望該疫苗可同時產生OprF及PcrV抗體以減弱不同血清型PA的致病性和耐藥性，同時全面誘導細胞、體液免疫，從而達到免疫保護的作用。此外，創新性地聯合PAEH/PEG DA水凝膠，以實現抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)對聯合DNA疫苗的長時間攝取，進一步增強聯合DNA疫苗的免疫效力，最終達到預防PA感染的目的。

1 材料與方法

1.1 材料及實驗動物 L-天冬氨酸購自上海麥克林生化科技有限公司，聚乙二醇由光復精細化工研究所提供，pVAX1-OprF和pVAX1-PcrV重組質粒、OprF和PcrV抗原蛋白購自上海生工生物有限公司并保存于–80 ℃，小鼠骨髓源樹突狀細胞DC 2.4由本實驗室保存，EntransterTM-in vivo體內轉染試劑(En)購自北京英格恩生物有限公司，胎牛血清購自上海VivaCell逍鵬生物科技有限公司，RPMI 1640細胞培養基、CCK-8試劑盒購自重慶賽米克生物有限公司，無內毒素質粒大提試劑盒、單組份TMB顯色液、ELISA終止液購自北京索萊寶科技有限公司，小鼠γ干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。3-18臺式高速離心機購自湖南可成儀器設備有限公司，Varioskan LUX酶標儀、NanoDropTMone超微量紫外分光光度計購自美國Thermo公司，iCEN-24R低溫高速離心機購自杭州奧盛儀器有限公司。27只6～8周齡SPF級健康雌性BALB/c小鼠購自重慶醫科大學實驗動物中心，自由進食、飲水。本研究獲重慶醫科大學附屬第二醫院倫理委員會批準[第2019(137)號]。

1.2 PAEH和PEG DA的制備 根據參考文獻[12]的方法制備PAEH和PEG DA。通過L-天冬氨酸的熱縮聚反應合成聚天冬氨酸，然后將其溶于二甲基亞砜溶液，并在冰水浴條件下加入水合肼，室溫下反應24 h，在丙酮溶液中獲得PAEH。通過“簡單四步法”制備PEG DA。

1.3 PAEH/PEG DA水凝膠的制備 首先，室溫條件下分別稱取一定量的Na2HPO4和NaH2PO4固體粉末，溶于適量ddH2O中配制pH 5.4的緩沖體系。然后分別稱取一定量的PAEH和PEG DA固體粉末，溶于上述緩沖體系中，配制質量分數均為10%的PAEH溶液和PEG DA溶液。最后將上述兩種溶液等體積混合，無需額外刺激即可成膠。后續所用水凝膠無特殊說明均為此濃度。

1.4 室溫下PAEH/PEG DA水凝膠凝膠時間的測定

利用倒置試管法檢測水凝膠的凝膠時間。將配制好的水凝膠溶液及含pVAX1-PcrV的水凝膠樣品(pVAX1-PcrV質量濃度為0.1 μg/μl)置于EP管內，放置在25 ℃恒溫水浴鍋中，密切觀察凝膠溶液狀態，當倒置EP管30 s后溶液均不流動則視為水凝膠已完全凝膠化，記錄此時的時間即為水凝膠的凝膠時間。在相同實驗條件下分別測量3次取均值。

1.5 PAEH/PEG DA水凝膠細胞毒性實驗 采用CCK-8法檢測DNA疫苗pVAX1-PcrV水凝膠緩釋系統的細胞毒性。將DC 2.4細胞以5×104/孔的密度接種于96孔板，在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中培養過夜，按處理因素分為以下4組：對照組(10 μl PBS)、水凝膠組(Gel，5倍水凝膠稀釋液5 μl+PBS 5 μl)、En/pVAX1-PcrV組(P，En/pVAX1-PcrV 5 μl+PBS 5 μl)、水凝膠+En/pVAX1-PcrV組(GP，5倍水凝膠稀釋液5 μl+En/pVAX1-PcrV 5 μl)，其中En/pVAX1-PcrV復合物配制方法參照En說明書(DNA:En=1:2，V:V)。各組設3個復孔，在37 ℃、5% CO2條件下分別培養24、48 h后棄去原培養基，每孔加入CCK-8試劑10 μl及無血清培養基90 μl，37 ℃繼續孵育4 h，置于酶標儀中測定450 nm波長處的吸光度(OD)值，計算細胞存活率。

1.6 PAEH/PEG DA水凝膠體外降解及釋放實驗制備水凝膠及含pVAX1-PcrV的水凝膠(200 μl水凝膠中含pVAX1-PcrV 60 μg)，混勻后室溫下平衡1 h，然后向水凝膠及含pVAX1-PcrV的水凝膠中加入37 ℃預熱的PBS溶液500 μl，37 ℃下60 r/min恒溫振搖，取出全部上清液，將凝膠表面和管壁上殘余的液體用吸水紙擦凈后稱重，并在稱量完畢后補足37 ℃預熱的PBS溶液500 μl，利用超微量紫外分光光度計檢測上清液中pVAX1-PcrV重組質粒的濃度。

1.7 PAEH/PEG DA水凝膠體內降解性能及組織安全性檢測 將9只BALB/c小鼠隨機分為3組(n=3)，取水凝膠溶液200 μl注射于BALB/c小鼠背部皮下，分別于注射后30 min、2 d、7 d脫頸處死小鼠，對注射部位的凝膠進行拍照，觀察凝膠體內降解情況，同時收集凝膠周圍皮膚組織，4%多聚甲醛固定后行HE染色，觀察該水凝膠在小鼠體內的組織安全性。

1.8 動物免疫方案 將18只BALB/c小鼠隨機分為6組(n=3)：對照組(PBS)、水凝膠組(Gel)、En/pVAX1-OprF組(O)、En/pVAX1-PcrV組(P)、En/(pVAX1-OprF+pVAX1-PcrV)組(OP)、水凝膠+En/(pVAX1-OprF+pVAX1-PcrV)組(GOP)。體內轉染試劑En與質粒DNA的配制參照說明書進行。各組小鼠背部皮下注射相應免疫制劑200 μl/只，其中O組、P組每只小鼠含相應質粒DNA 20 μg，OP組、GOP組每只小鼠含兩種質粒DNA各10 μg。首次免疫后，每隔10 d加強免疫1次，共免疫3次，于末次免疫2周后脫頸處死小鼠。

1.9 血清特異性IgG抗體檢測 各組小鼠在末次免疫2周后行眼球摘除法采血并分離血清，參考文獻[14]中的方法，利用間接ELISA法檢測血清中特異性IgG抗體水平，其中，特異性抗OprF IgG抗體檢測分為PBS組、Gel組、O組、OP組和GOP組，而特異性抗PcrV IgG抗體檢測分為PBS組、Gel組、P組、OP組和GOP組。兩種特異性IgG抗體檢測分別以OprF和PcrV蛋白(濃度均為5 μg/ml)作為包被抗原包被酶標板，以100倍稀釋的小鼠血清為一抗，250倍稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體為二抗，采用間接ELISA法測定血清特異性抗OprF IgG抗體和抗PcrV IgG抗體水平。

1.10 脾淋巴細胞增殖實驗 采用CCK-8法檢測免疫小鼠脾淋巴細胞的增殖情況。末次免疫2周后脫頸處死小鼠，無菌分離各組小鼠脾臟，參考文獻[15]中的方法制備脾淋巴細胞懸液，調整細胞密度為2×106/ml，每孔加細胞懸液100 μl于96孔板中，設置兩個組，分別加入OprF蛋白和PcrV蛋白(濃度均為10 μg/ml)進行特異性刺激，隨后將其放置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育72 h，然后加入10 μl CCK-8試劑，用酶標儀于450 nm波長處測定各組OD值，并計算脾淋巴細胞刺激指數(stimulation index，SI)。

1.11 IFN-γ水平檢測 按照1.10的方法制備脾淋巴細胞懸液，并于96孔板中培養，設置兩個組，分別用OprF和PcrV蛋白(濃度均為10 μg/ml)刺激各組淋巴細胞，于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育72 h后收集上清液，參照小鼠IFN-γ檢測試劑盒說明書檢測各組脾淋巴細胞分泌的IFN-γ水平。

1.12 統計學處理 采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。所有數據均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PAEH/PEG DA水凝膠的凝膠時間 PAEH上的肼基可與PEG DA上的醛基1:1反應形成動態酰腙鍵，PAEH/PEG DA水凝膠的制備機制及其凝膠化過程見圖1。倒置試管法測定室溫下PAEH/PEG DA水凝膠的凝膠時間，結果顯示，在25 ℃條件下，空白PAEH/PEG DA水凝膠凝膠時間為(29.39±0.26) min，載pVAX1-PcrV的PAEH/PEG DA水凝膠凝膠時間為(29.45±0.25) min，二者無明顯差異，均可在30 min內形成穩定的凝膠態。

圖1 PAEH/PEG DA水凝膠的制備機制(A)及凝膠示意圖(B)Fig.1 Preparation mechanism (A) and gelation schematic (B) of PAEH/PEG DA hydrogel

2.2 PAEH/PEG DA水凝膠的細胞毒性 檢測凝膠化濃度以下的PAEH/PEG DA水凝膠緩釋系統對DC 2.4細胞的毒性，結果顯示，與PBS組比較，Gel組、P組及GP組24及48 h的細胞存活率均在90%以上，差異無統計學意義(P>0.05，圖2)，提示PAEH/PEG DA水凝膠具有良好的細胞安全性，且負載En/pVAX1-PcrV復合物后仍無明顯細胞毒性，可進一步用于體內研究。

圖2 不同處理因素對DC 2.4細胞處理24 h (A)和48 h (B)的體外細胞毒性分析(±s, n=3)Fig.2 In vitro cytotoxicity of different treatments to DC 2.4 cells for 24 h (A) and 48 h (B) (±s, n=3)

2.3 PAEH/PEG DA水凝膠的體外降解及釋放 水凝膠體外降解實驗結果顯示，初始水凝膠質量有所增加，6 h到達峰值(116%)，隨后凝膠質量不斷下降，在108 h時，水凝膠質量約為原有質量的20%，提示水凝膠具有良好的體外降解性能(圖3A)。利用無膜溶出法評價該水凝膠的體外釋放特性，在不同時間點檢測水凝膠釋放介質中pVAX1-PcrV的含量以計算水凝膠釋放介質中pVAX1-PcrV的累積釋放率，結果發現，在體外釋放36 h后，該水凝膠累積釋放出pVAX1-PcrV總量的85%左右(圖3B)。

圖3 PAEH/PEG DA水凝膠的體外降解曲線(A)和體外釋放曲線(B) (±s, n=3)Fig.3 In vitro degradation curve (A) and in vitro release curve (B) of PAEH/PEG DA hydrogel (±s, n=3)

2.4 PAEH/PEG DA水凝膠的體內降解性能及組織安全性 水凝膠體內降解實驗結果顯示，將液態的水凝膠注射到皮下后，即可在原位形成凝膠，隨著時間的推移，水凝膠在體內逐漸降解，注射7 d后觀察到水凝膠幾乎完全降解(圖4A)，表明該水凝膠具有良好的生物可降解性。HE染色結果顯示，皮膚組織保持完整的表皮和真皮結構，膠原束排列緊密有序(圖4B)。

圖4 PAEH/PEG DA水凝膠體內降解(A)及注射部位皮膚組織HE染色(B)Fig.4 In vivo degradation of PAEH/PEG DA hydrogel (A), and representative skin tissue of hydrogel injection site (B, HE staining)

2.5 血清抗體檢測結果 間接ELISA法檢測結果顯示，與PBS組比較，Gel組小鼠血清特異性抗OprF IgG抗體水平無明顯變化(P>0.05)，而O組、OP組及GOP組小鼠血清特異性抗OprF IgG抗體水平明顯升高(P＜0.01)，且OP組和GOP組明顯高于O組(P＜0.05，P＜0.01)，GOP組明顯高于OP組(P＜0.05)(圖5A)。與PBS組比較，Gel組和P組小鼠血清特異性抗PcrV IgG抗體水平無明顯變化(P>0.05)，而OP組和GOP組小鼠血清特異性抗PcrV IgG抗體水平明顯升高(P＜0.01)，且OP組和GOP組明顯高于Gel組和P組(P＜0.05)，GOP組明顯高于OP組(P＜0.01)(圖5B)。

圖5 免疫小鼠血清特異性IgG抗體水平(±s, n=3)Fig.5 Serum specific IgG antibody levels of immunized mice (±s, n=3)

2.6 脾淋巴細胞增殖實驗結果 CCK-8法檢測結果顯示，在OprF特異性抗原刺激下，與PBS組比較，Gel組脾淋巴細胞SI無明顯變化(P>0.05)，而O組、OP組及GOP組脾淋巴細胞SI明顯升高(P＜0.01)，且OP組及GOP組明顯高于O組(P＜0.05)，GOP組明顯高于OP組(P＜0.05)(圖6A)。在PcrV特異性抗原刺激下，與PBS組相比，Gel組脾淋巴細胞SI無明顯變化(P>0.05)，而P組、OP組和GOP組脾淋巴細胞SI明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，且OP組及GOP組明顯高于P組(P＜0.05，P＜0.01)，GOP組明顯高于OP組(P＜0.05)(圖6B)。

圖6 抗原刺激后各組小鼠脾淋巴細胞刺激指數(SI)比較(±s, n=3)Fig.6 Comparison of the stimulation index (SI) of splenic lymphocytes from mice immunized (±s, n=3)

2.7 不同抗原刺激下脾淋巴細胞分泌的IFN-γ水平 ELISA法檢測結果顯示，在OprF特異性抗原刺激下，與PBS組相比，Gel組脾淋巴細胞分泌的IFN-γ水平無明顯變化(P>0.05)，而O組、OP組及GOP組小鼠脾淋巴細胞分泌的IFN-γ水平明顯升高(P＜0.01)，且OP組及GOP組明顯高于O組(P＜0.01)，GOP組明顯高于OP組(P＜0.05)(圖7A)。在PcrV特異性抗原刺激下，與PBS組比較，Gel組脾淋巴細胞分泌的IFN-γ水平無明顯變化(P>0.05)，而P組、OP組及GOP組小鼠脾淋巴細胞分泌的IFN-γ水平明顯增高(P＜0.01)，且OP組及GOP組明顯高于P組(P＜0.05，P＜0.01)，GOP組明顯高于OP組(P＜0.01)(圖7B)。

圖7 ELISA法檢測抗原刺激后各組小鼠脾淋巴細胞上清液中IFN-γ的濃度(±s, n=3)Fig.7 Concentration of IFN-γ in the supernatant of antigen-stimulated splenic lymphocytes of immunized mice in each group(Determined by ELISA, ±s, n=3)

3 討 論

PA是導致院內感染的常見病原體之一，而當前新抗菌藥物的研發嚴重不足，難以應對日益嚴重的PA耐藥的威脅，因此亟需開發一種PA疫苗來防治PA感染。近年來，隨著基因工程技術的發展，直接利用抗原表位基因構建DNA疫苗已成為主流的研究方向之一[16]。DNA疫苗雖然具有安全性高、易于制備多價疫苗等優勢，但在體內易受pH值及酶等因素的影響而被降解和滅活，限制了其臨床應用[13]。因此，探索新的DNA疫苗遞送系統對提高DNA疫苗的免疫效力，有效防治PA感染具有重要意義。

本研究在課題組前期研究的基礎上，構建了載PAOprF和PcrV基因聯合DNA疫苗的PAEH/PEG DA水凝膠緩釋系統。該系統具有易于制備、便于免疫注射和增強DNA疫苗免疫效力等優點。本研究結果顯示，在室溫條件下，載PA DNA疫苗的PAEH/PEG DA水凝膠緩釋系統可在30 min內形成穩定的凝膠，提示該緩釋系統具有良好的可注射性，有望在注射部位形成穩定的凝膠疫苗儲庫。相較于傳統溫敏水凝膠不易與DNA疫苗制劑混合、在常溫條件下注射性差等缺點，PAEH/PEG DA水凝膠具有易于制備、與DNA疫苗制劑混合均勻、便于注射等優點，避免了混合不均勻導致的無效釋放，確保了水凝膠的緩釋作用。因組織安全性是生物材料在體內應用的前提，本研究評價了含或不含En/DNA疫苗復合物水凝膠溶液的細胞毒性，結果顯示PAEH/PEG DA水凝膠具有良好的細胞及組織安全性，可進一步用于DNA疫苗的體內遞送。體內外降解實驗表明，該凝膠約7 d即可完全降解，具有良好的生物可降解性；體外釋放實驗表明，該凝膠可持續緩慢地釋放所負載的DNA疫苗，有望延長DNA疫苗在體內的存留時間，從而持續刺激免疫系統，提高DNA疫苗的有效性。

近年來研究發現，OprF和PcrV基因高度保守、免疫原性好、與PA致病及耐藥高度相關，相應抗體及疫苗對小鼠感染模型均有免疫保護作用[9-10,17]。體液免疫和細胞免疫是機體抵抗細菌感染的主要因素，IgG抗體水平直接反映機體的體液免疫水平[18]，脾淋巴細胞作為機體的重要免疫細胞，其增殖及細胞因子IFN-γ分泌水平是細胞免疫反應的重要指標[19]。本研究證實PAEH/PEG DA水凝膠材料本身不具有特異性免疫原性，與PBS一樣，在小鼠體內不會誘發免疫反應。單基因OprFDNA疫苗可引起小鼠體內產生細胞及體液免疫反應，與課題組前期研究結果一致[13]。單基因PcrVDNA疫苗組小鼠脾淋巴細胞增殖明顯，IFN-γ水平升高，而IgG抗體水平無明顯變化，表明PcrVDNA疫苗可引起小鼠體內產生細胞免疫反應，但其誘導產生體液免疫反應的能力不足，與Jiang等[14]的研究一致，可能與PcrVDNA疫苗免疫原性不足有關。本研究聯合OprF和PcrV作為候選抗原，與單基因OprF或PcrVDNA疫苗相比，聯合DNA疫苗可產生更多的抗OprF和抗PcrV抗體，表明其具有更強的體液免疫誘導能力。通過對免疫小鼠脾淋巴細胞增殖和細胞因子IFN-γ分泌水平的測定，發現聯合DNA疫苗對脾淋巴細胞增殖的誘導作用強于單基因OprF或PcrVDNA疫苗，且聯合DNA疫苗在OprF或PcrV抗原刺激下均能誘導有效的IFN-γ分泌，其效果優于單基因OprF或PcrVDNA疫苗。以上結果表明，相較于單基因OprF或PcrVDNA疫苗，OprF和PcrV基因聯合DNA疫苗具有更強的免疫原性，能誘導更強的細胞及體液免疫。

本研究還發現，易制備、具有緩釋性能的PAEH/PEG DA水凝膠系統可進一步增強聯合DNA疫苗誘導的細胞及體液免疫反應，考慮可能的原因為水凝膠包載聯合DNA疫苗在注射部位形成凝膠疫苗儲庫，避免了部分DNA疫苗的直接降解，同時能夠持續緩慢地釋放DNA疫苗，使注射部位周圍的DNA疫苗濃度保持在一個較高的水平，以延長APC對DNA疫苗的攝取時間，從而持續刺激機體免疫系統，引發更強的免疫反應[13,20]。

綜上所述，本研究在前期研究的基礎上，進一步優化了載DNA疫苗的水凝膠緩釋系統，制備了PAOprF和PcrV基因聯合DNA疫苗，獲得載PAOprF和PcrV基因聯合DNA疫苗的PAEH/PEG DA水凝膠緩釋系統，并在體液免疫和細胞免疫層面證實了該緩釋系統的優良免疫效力。但本研究尚缺少免疫保護實驗，后續研究可構建PA感染小鼠模型并驗證該系統的免疫保護作用，為研發有效、安全、經濟的PA疫苗提供新的策略，為預防PA引起難治性感染奠定實驗基礎。