RPDPC對宮頸癌HeLa細胞增殖與凋亡的影響及其機制

陳鳳，曾小華，張斌強，李斌，王彥嬌，陳琴華，柯麗娜*

1錦州醫科大學國藥東風總醫院研究生培養基地，湖北 十堰 442008；2湖北醫藥學院國藥東風總醫院婦產科，湖北 十堰 442008；3武當特色中藥研究湖北省重點實驗室(湖北醫藥學院)，湖北 十堰 442008

宮頸癌為婦科常見癌癥，是女性癌癥死亡的第四位疾病[1]。全球宮頸癌新發病例數已從2012年的52.8萬例增加到2020年的59.8萬例，死亡數從2012年的26.6萬例增加到2020年的33.8萬例，且發展中國家發病率是發達國家的3～10倍[2]。手術及化療是宮頸癌目前主要的治療手段，化療首選以順鉑為主的鉑類藥物；然而，已有的化療藥物只能使晚期宮頸癌患者的5年生存率略有提高，治療效果和預后很不理想[3-4]。因此，迫切需要探尋抗宮頸癌安全有效且不易產生耐藥性的藥物[5]。Hiroyasu研究團隊從沖繩被囊類動物Rhopalaea sp.的提取物中分離出4種包含咪唑啉酮結構的雙(吲哚)生物堿即Rhopaladins A－D，對人類腫瘤細胞株有顯著的細胞毒作用[6]。我們前期合成了海洋生物堿Rhopaladins的類似物RPDPC(化學名：E-N-叔丁基-1-異丙基-4-對氟芐叉基-2-對溴苯甲酰基-5-吡咯烷酮-2-酰胺)，本研究旨在探討RPDPC對宮頸癌HeLa細胞增殖與凋亡的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑及儀器 宮頸癌HeLa細胞、正常肝細胞LO2購自中國武漢普諾賽公司；胎牛血清購自中國CellMax公司；MEM培養基購自美國HyClone公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)購自美國Targetmol公司；Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒購自中國聯科生物技術有限公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自日本TOYOBO公司；microRNA反轉錄盒、miScript SYBR Green PCR Kit購自德國QiaGen公司；PCR引物由中國上海生工生物有限公司合成；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)購自中國Antgene公司；流式細胞儀購自美國BD公司；熒光定量PCR儀購自德國耶拿公司；抗PTEN抗體、抗p-PI3K抗體、抗PI3K抗體、抗p-Akt抗體、抗Akt抗體購自美國Abcam；二抗購自美國Boster公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自中國碧云天生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和分組 在含有10%胎牛血清的MEM細胞培養基中培養細胞，1～2 d換液1次，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中孵育培養，待細胞長滿瓶底80%～90%時按1:3傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。RPDPC溶于二甲基亞砜(DMSO)中，配成不同濃度的母液后保存在–20 ℃冰箱中。陰性對照組加入等量的DMSO，實驗組為不同濃度RPDPC的DMSO溶液。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞存活率 將HeLa細胞以4×103個/孔的密度種在96孔板中，次日待細胞貼壁后去除原培養基，加入含RPDPC(3.125 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L、100.0 μmol/L)的培養基200 μl，分別培養24 h、48 h、72 h；以DMSO為陰性對照組，順鉑(PT)為陽性對照組；以正常肝細胞進行細胞毒性實驗。每組設置3個復孔，CCK-8與MEM培養基按1:10的比列混合后每孔加入110 μl，放入37 ℃、5%CO2細胞培養箱中避光孵育1.5 h，在酶標儀上測定450 nm波長處的吸光度，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=[A實驗組–A空白]/[ADMSO–A空白]×100%。

1.2.3 Hoechst 33258染色觀察HeLa細胞形態 將HeLa細胞以2×106個/孔的密度接種在6孔板中，次日細胞貼壁后加入試劑，孵育48 h后加入500 μl固定液，固定10 min，PBS沖洗2次，每次3 min。500 μl Hoechst 33258染色5 min后，用PBS清洗細胞2次，每次3 min。熒光顯微鏡下觀察各組細胞。

1.2.4 Annexin V/PI雙染法檢測HeLa細胞凋亡率將Hela細胞接種在6孔板中，密度為2×106個/孔；次日細胞貼壁后去除上清培養液，加入不同濃度的RPDPC培養液，每孔2 ml，藥物作用48 h后用不含EDTA的胰酶收集細胞懸液，1000g/min離心5 min，沉淀細胞用孵育緩沖液洗1次，用結合緩沖液重懸細胞后加入Annexin V-FITC 5 μl和PI 10 μl，采用流式細胞儀進行細胞凋亡率檢測。實驗重復3次。

1.2.5 實時定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測HeLa細胞癌基因E6、E7和PTEN、PI3K、Akt的mRNA及miR-21表達水平 將HeLa細胞以2×106個/孔的密度接種在6孔板中；次日細胞貼壁后去除上清培養液，加入不同濃度的RPDPC培養液，每孔2 ml，藥物作用48 h后加入TRIzol試劑裂解細胞，抽提總RNA，測定總RNA濃度，按照反轉錄試劑盒操作說明書操作，反轉錄得到雙鏈cDNA。利用SYBR Green PCR Master Mix和miScript SYBR Green PCR Kit擴增并檢測mRNA。以GAPDH為內參，利用SYBR Green PCR Master Mix測定E6、E7、PTEN、PI3K和Akt的mRNA表達水平。E6、E7的PCR擴增程序為：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環。PTEN、PI3K和Akt的PCR擴增程序為：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環。以U6RNA作為miR-21的內參對照，miScript SYBR Green PCR Kit檢測miR-21的表達水平，PCR擴增程序為：95 ℃預變性15 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40個循環。每個樣本設3個復孔，實驗重復3次。采用2–ΔΔCt法計算基因的相對表達量。所用引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

1.2.6 Western blotting檢測PTEN/PI3K/Akt信號通路蛋白表達水平 將HeLa細胞以2×106個/孔的密度接種在6孔板中；次日細胞貼壁后去除上清培養液，加入不同濃度的RPDPC培養液，每孔2 ml，藥物作用48 h后用PBS洗一次，用含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液在冰上裂解40 min，B C A法測定蛋白濃度，保存在–80 ℃冰箱。以GAPDH作為內參，制備10%的分離膠和5%的濃縮膠進行凝膠電泳分離，蛋白樣品上樣10 μg。濃縮膠：80V 30 min；分離膠：120V 90 min。在150 mA條件下轉膜60 min；37 ℃封閉1 h，加入一抗稀釋液GAPDH(1:5000)、PTEN(1:1000)、p-PI3K(1:1000)、PI3K(1:1000)、p-Akt(1:500)、Akt(1:500)，4 ℃過夜，加入二抗稀釋液(1:5000)孵育1 h，曝光儀曝光，記錄成像結果。使用Image J軟件分析蛋白灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。數據均符合正態分布，以±s表示，采用單因素方差分析進行組間比較，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 對HeLa細胞和肝細胞存活率的影響 CCK-8法檢測結果顯示，與對照組(DMSO)比較，RPDPC處理后HeLa細胞存活率下降，且隨時間和濃度的增加，細胞存活率持續下降，具有明顯的時間和濃度依賴性(P＜0.05，圖1A)。采用GraphPad Prism軟件計算，HeLa細胞24 h、48 h、72 h的RPDPC半數抑制濃度(IC50)分別為44.1 μmol/L、28.9 μmol/L、26.1 μmol/L；Hela細胞48 h的順鉑IC50值為32.2 μmol/L(圖1B)。據此，后續實驗研究選取12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L RPDPC分別處理HeLa細胞48 h。藥物毒性實驗結果顯示，RPDPC對正常肝細胞LO2的IC50為200.0 μmol/L(圖1C)。

圖1 RPDPC對HeLa細胞和肝細胞存活率的影響(n=6)Fig.1 Effects of cell viabilities of HeLa cells and hepatocytes treated by RPDPC (n=6)

2.2 HeLa細胞的形態觀察 Hoechst 33258染色顯示，對照組細胞生長良好，細胞數多且形態呈正常的梭形(圖2A)；與對照組比較，RPDPC處理48 h后，隨RPDPC濃度的遞增(12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L)，各組細胞數持續減少，細胞間隙增寬，死亡細胞、細胞碎片增多，細胞皺縮、形態失常變化更加明顯(圖2B－D)。

圖2 RPDPC處理48 h后HeLa細胞的Hoechst 33258 染色結果(n=6, ×100)Fig.2 Morphological observation of HeLa cells treated by RPDPC in each group (n=6, ×100)

2.3 各組HeL a細胞凋亡率比較 A nnex inⅤ-FITC/PI雙染處理各組細胞并用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結果顯示，對照組、RPDPC處理組(12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L)的HeLa細胞凋亡率(%)分別為13.2±1.7、21.8±4.5、33.8±3.4、46.7±6.7；與對照組比較，各組HeLa細胞凋亡率均明顯增高(P＜0.05)；不同濃度RPDPC處理組HeLa細胞凋亡率比較，差異均有統計學意義(P＜0.05，圖3)。

圖3 RPDPC處理后各組HeLa細胞凋亡率比較(n=6)Fig.3 Comparison of the apoptosis rates of HeLa cells in each group treated by RPDPC (n=6)

2.4 HeLa細胞miR-21和E6、E7、PTEN、PI3K、AktmRNA表達水平的變化 qRT-PCR檢測結果顯示，與對照組比較，經12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L RPDPC處理48 h后，HeLa細胞中E6、E7、PI3K、Akt mRNA及miR-21的相對表達量均降低，PTENmRNA相對表達量升高，均呈濃度依賴性，差異有統計學意義(P＜0.05，圖4)。

圖4 RPDPC處理后各組HeLa細胞中E6、E7、PTEN、PI3K、Akt mRNA及miR-21相對表達水平比較(n=6)Fig.4 Comparison of the expression levels of miR-21 and mRNA of E6, E7, PTEN, PI3K, Akt in HeLa cells of each group treated by RPDPC (n=6)

2.5 He L a 細胞中凋亡相關通路蛋白的表達Western blotting檢測結果顯示，與對照組比較，12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L RPDPC處理48 h后，各組HeLa細胞中PTEN蛋白表達水平均明顯增高(P＜0.05)，且不同濃度組間差異明顯(P＜0.05)；PI3K、p-PI3K、p-Akt和Akt蛋白表達水平均明顯降低(P＜0.05)，且不同濃度組間差異明顯(P＜0.05，圖5)。

圖5 RPDPC處理后各組HeLa細胞中PTEN、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt相對蛋白表達水平比較(n=6)Fig.5 Comparison of the expression levels of PTEN, p-PI3K, PI3K, p-Akt and Akt in HeLa cells of each group treated by RPDPC(n=6)

3 討 論

海洋面積與地球表面的70%，海洋生物特別是海洋無脊椎動物(如海綿、海鞘等)是藥用分子的豐富來源，其中部分化合物具有獨特的結構，對癌細胞具有細胞毒性。到2020年底，近10種臨床批準的抗癌藥物是以海洋生物中分離出的小分子化合物為基礎開發而來，還有近1000種相關的新結構化合物處于不同臨床試驗階段[7-8]。因此，海洋生物用于新藥開發具有較大潛力，引起了多個學科的關注；其中部分雜環化合物具有特殊而廣泛的作用，部分含吡咯烷酮結構的雜環衍生物在醫藥、化工等領域有較好的應用前景，已有研究顯示部分相關化合物具有顯著的抗病毒、抗艾滋病、抗肌肉堿或抗癲癇作用[9]。1998年一類雙(吲哚)生物堿從沖繩海洋被囊動物Rhopalaea sp.中被提取，即Rhopaladin A－D四種海洋生物堿，具有staurosporine型骨架或來自被囊動物的哌嗪環，是第一批被報道有咪唑啉酮結構的雙(吲哚)生物堿，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等多種生物活性作用[6]。其中，Rhopaladin B可抑制細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK4)和酪氨酸激酶 C-erbB2的表達，而C-erbB2的表達與宮頸癌的發生發展密切相關；Rhopaladins C對黃鏈球菌和棒狀桿菌均有抗菌活性。Rhopaladins的生物學特性使它們有望成為新型抗腫瘤藥物，但要大量獲取這些生物堿及其類似物，較為可行的途徑是化學合成。我們前期合成了Rhopaladins的類似物RPDPC，化學名為E-N-叔丁基-2-對氯苯甲酰基-1-異丙基-4-對氟芐叉基-5-吡咯烷酮-2-酰胺；合成方法為多組分一鍋合成法，構建具有與Rhopaladins結構類似的母核及取代芳基(分子式及選擇策略見圖6)[10-11]。本研究觀察了RPDPC對宮頸癌HeLa細胞的作用，初步探討其可能的作用機制。CCK-8法檢測結果顯示，與對照組(DMSO)比較，12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L RPDPC干預后宮頸癌HeLa細胞的活力受到抑制，且隨時間延長和RPDPC濃度增高，抑制作用更加明顯；AnnexinⅤ-FITC/PI雙染觀察RPDPC對HeLa細胞凋亡的影響，結果顯示與對照組比較，實驗組HeLa細胞凋亡率明顯升高，且濃度越高促凋亡作用越明顯，提示RPDPC可能抑制宮頸癌細胞的增殖，誘導癌細胞凋亡。

圖6 選擇RPDP A－C 作為目標分子的合成策略Fig.6 The synthesis strategy for RPDP A–C as targets

持續感染高危人乳頭瘤病毒(HPV)是誘發宮頸癌的主要原因；90.8%的宮頸癌患者感染了高危型HPV，而宮頸鱗癌和腺癌與HPV16、HPV18長期感染密切相關[12]。故本研究選用HPV18陽性的Hela細胞為研究對象。E6和E7是HPV18編碼的兩種主要病毒癌基因，它們的表達水平決定了HPV的致癌力。有研究顯示，在HPV陽性的宮頸癌患者活檢組織和HPV陽性細胞中E6和E7是最豐富的病毒轉錄本，提示E6和E7在HPV病毒復制和致癌進展中發揮關鍵作用[13-16]。E6和E7序列的開放閱讀框直接參與調節宮頸癌細胞的生長，在其增殖中起重要作用，并與宮頸癌細胞的凋亡密切相關[17]。本研究qRT-PCR結果顯示，與對照組比較，不同濃度RPDPC處理的HeLa細胞E6和E7mRNA表達水平均明顯降低，且RPDPC濃度越高mRNA表達水平降低越顯著，提示RPDPC對宮頸癌細胞的作用可能與E6、E7的低表達密切相關。

MicroRNAs(miRNAs)是一類短小的非編碼RNA，是基因表達的關鍵調控因子。miRNAs的異常表達可影響多種腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化及代謝等。miRNAs通過部分序列同源性與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(3'-UTR)結合，調節mRNA的表達，從而在多種真核生物的基因表達調控和發育動力學中發揮關鍵作用[18]。miRNAs可參與宮頸癌的發生發展，如miR-21是已知在多種類型的人類癌癥中上調的主要腫瘤因子，是宮頸癌細胞系和腫瘤樣本中表達較豐富的一種miRNA；過度表達的E6、E7可上調miR-21的表達。已有研究顯示抑癌基因PTEN是宮頸癌miR-21的基因靶點；PTEN在腫瘤發展過程中是一種抑制因子，可以負向調節PI3K/Akt軸，而PI3K/Akt信號通路與癌細胞的增殖、凋亡有關[19-20]。本研究結果顯示，與對照組比較，RPDPC處理的各組HeLa細胞miR-21表達水平明顯下調，PTENmRNA和PTEN蛋白表達水平明顯上調，PI3KmRNA和p-PI3K、PI3K蛋白的表達水平明顯下調，AktmRNA和p-Akt、Akt蛋白表達水平明顯下調，提示miR-21/PTEN/PI3K/Akt信號軸可能參與了RPDPC對宮頸癌細胞的抑制作用。

綜上所述，本研究結果顯示，RPDPC在體外可抑制宮頸癌HeLa細胞增殖，誘導其凋亡；相關作用機制可能是RPDPC通過miR-21/PTEN/PI3K/Akt信號通路抑制HPV的癌基因E6、E7表達；提示RPDPC對于宮頸癌有潛在的抗腫瘤作用，有望用于宮頸癌治療的研究。但不足之處在于，本研究僅開展了體外細胞實驗，僅觀察了RPDPC調節E6、E7的表達及對21/PTEN/PI3K/Akt信號通路的影響，是否存在其他相關基因與信號通路的參與，尚待進一步驗證，RPDPC的抗腫瘤作用也有待后續動物實驗進一步驗證。