HMB在小鼠急性呼吸窘迫綜合征相關ICU獲得性衰弱中的作用及其機制

潘曉佳，徐朝霞，林寧，林正霄，趙磊，馮健*，李福祥*

1西南交通大學醫學院，四川 成都 610031；2西部戰區總醫院重癥醫學科，四川 成都 610083；3西部戰區總醫院營養科，四川 成都 610083

ICU獲得性衰弱(ICU-acquired weakness，ICUAW)是危重癥患者常見的獲得性神經肌肉功能障礙，中后期患者的病死率及致殘率居高不下[1-2]。但目前尚無有效的干預措施能持續地預防危重癥患者的肌肉損失，主要原因在于其發病機制不完全清楚。既往研究表明，E3泛素連接酶的肌環指蛋白1(muscle ring finger protein l，MuRF1)及肌萎縮盒F蛋白(atrogun 1/muscle atrophy F-box，Atrogin1/MAFbx)與肌肉蛋白質的降解密切相關，在ICU-AW發病過程中發揮重要作用[3]。另有研究表明，叉頭框蛋白O(forkhead box O，FoxO)能夠通過磷酸化與非磷酸化的轉化調控MuRF1及Atrogin1的表達[4-6]。在FoxO蛋白家族成員中，FoxO3a缺失較少受到其他因素的補償，表明FoxO3a是萎縮程序的關鍵因素。而蛋白激酶B(protein kinase B，Akt/PKB)對FoxO3a的表達及磷酸化/非磷酸化轉化過程具有調控作用[7]，當FoxO被Akt磷酸化后，會向細胞質中轉位，從而失去對肌萎縮基因的調控作用；非磷酸化的FoxO位于細胞核中，可通過促進肌萎縮基因MuRF1及Atrogin1等的表達，加劇肌萎縮[8]。上述研究提示，Akt-FoxO3a-MuRF1/Atrogin1信號通路在骨骼肌蛋白降解途徑中發揮著重要作用，但其在ICU-AW中的作用機制尚不完全清楚。β-羥基-β-甲基丁酸(β-hydroxy-β-methylbutyrate，HMB)是一種安全有效的營養補充劑，也是必需支鏈氨基酸亮氨酸的代謝物[9]。有文獻報道，HMB可用于增強骨骼肌的質量及強度，在老年人及癌癥相關的惡病質患者中，補充HMB可以減少骨骼肌萎縮[10-11]，但其具體的作用機制以及是否通過Akt-FoxO3a-MuRF1/Atrogin1這一經典信號通路發揮作用尚不清楚。因此，深入研究HMB改善骨骼肌萎縮的機制對ICU-AW的防治具有重要意義。本研究觀察了HMB對急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)相關的ICU-AW小鼠骨骼肌形態學及功能的影響，并探討了其作用機制，以期為ICU-AW的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8～10周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠60只，體重(27.2±1.3) g，購自成都達碩實驗動物有限公司[動物許可證號：SCXK(川)2020-030]。動物SPF級常規飼養，室溫維持在20～25 ℃，12 h光照與黑暗交替，給予常規飼料自由飲食，正式實驗開始前適應性飼養2周。本研究獲得西部戰區總醫院實驗動物倫理委員會批準(批準號：2020ky025)，實驗過程符合國家及單位有關實驗動物的管理及使用規定。

1.2 主要試劑 HMB購于上海麥克林生物科技股份有限公司，大腸埃希菌(O55：B5L2880)脂多糖(LPS)購于美國Sigma公司，全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司，抗體MuRF1、Atrogin1及山羊抗兔二抗均購于英國Abcam公司，抗體β-tubulin、Akt、p-Akt、FoxO3a、p-FoxO3a均購于美國Cell Signaling公司，qRT-PCR引物購于四川生工科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 動物分組及模型建立 選取40只小鼠，采用隨機數字表法分為對照組、假手術組、模型組及HMB組，每組10只。按照Files等[12]的方法于小鼠氣管內滴注LPS，建立ARDS相關ICU-AW模型，動物術前稱重、編號，禁食12 h，自由飲水。于小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)，待麻醉生效后將動物仰臥固定于操作臺上，頸部正中切開5～8 mm，鈍性分離皮下組織，暴露氣管。用微型注射器由氣管向肺分向注射，模型組及HMB組小鼠氣管內注入3 μg/g LPS，1 min內注射完畢；假手術組給予等體積生理鹽水，注射后立即將動物直立并旋轉，使藥物均勻分布于兩肺。縫合皮膚，待小鼠蘇醒后放回飼養籠。自模型建立第2天開始，HMB組以340 mg/(kg·d) HMB灌胃[13]，其余3組給予等體積生理鹽水，連續給藥2周。另取與HMB組相同處理的小鼠20只，隨機分為ARQ-092組與Akt抑制劑對照組，每組10只。在0.01 mol/L磷酸載體(pH值7.25)中配制ARQ-092，從造模后第2天開始，ARQ-092組在HMB灌胃10 h后口服100 mg/kg ARQ-092[14-15]，1次/d，持續12 d，Akt抑制劑對照組給予等體積磷酸載體。

1.3.2 肌肉力量評估 造模開始至第16天，每天用無創爪抓力測試儀測量小鼠前肢肌肉抓力[16-17]。將小鼠的前肢放在爪抓力測試儀金屬板上，逐漸向后拉，當小鼠爪子松開時會收縮肢體，此時，金屬板連接著的力傳感器可測量當前產生卸力的量程，此數據為小鼠當次的抓力值，連續測量5次，結果取平均值[18]。

1.3.3 肌肉減少指數(sarcopenia index，SI)檢測 造模第16天后處死小鼠，稱量各組小鼠體重并記錄。采用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，分離腓腸肌并剔除肌腱等結締組織，取出腓腸肌后浸入生理鹽水，洗去附著的血液，稱量前用濾紙吸除多余的生理鹽水及組織液，稱量骨骼肌質量，計算小鼠腓腸肌質量(mg)與體重(g)的比值，即SI。

1.3.4 肺組織及肌肉組織病理學檢查 取造模48 h小鼠的肺組織及干預完成后小鼠的腓腸肌，迅速放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h，脫水，常規石蠟包埋，4 μm厚度切片，按照HE染色試劑盒操作說明書步驟進行HE染色，并在光學顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.5 qRT-PCR檢測相關基因mRNA的表達 采用qRT-PCR檢測腓腸肌中Akt、FoxO3a、MuRF1及Atrogin1mRNA的表達水平，引物序列見表1。采用Trizol法提取腓腸肌組織標本中的總RNA，離心、洗滌、再溶解，測定總RNA純度及濃度。一步法qRT-PCR反應條件：反轉錄反應42 ℃ 5 min，95 ℃10 s；PCR反應95 ℃ 15 s，63 ℃ 1 min，共40個循環。每孔為總體積25 μl含RNA的反應液，每組2～3個復孔。以GAPDH作為內參照，采用2–ΔΔCt法計算各組目的基因的相對表達量。

表1 基因引物序列Tab.1 Primer sequences of genes

1.3.6 Western blotting檢測腓腸肌中Akt、p-Akt、FoxO3a、p-FoxO3a、MuRF1及Atrogin1蛋白相對表達量 裂解腓腸肌組織，提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，經SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉后，加入相應的一抗Akt(1:1000)、p-Akt(1:1000)、FoxO3a(1:1000)、p-FoxO3a(1:1000)、Atrogin1(1:1000)、MuRF1(1:1000)、α-Tubulin (1:2000)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次后加入相應的辣根過氧化物酶標記二抗(1:2000)孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min。洗膜后DAB顯色，采用凝膠圖像分析系統拍照，以α-tubulin為內參照，對目的基因條帶灰度值進行統計分析。

1.4 統計學處理 使用GraphPad Prism V5及SPSS 20.0軟件進行制圖及數據分析。計量資料以±s表示，符合正態分布且方差齊時，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用t檢驗；方差不齊時采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠肺組織及腓腸肌組織形態比較 利用氣管內滴注LPS建立ARDS相關ICU-AW小鼠模型，造模48 h的肺組織HE染色結果顯示，對照組及假手術組小鼠肺泡結構完整，無損傷表現；模型組及HMB組出現肺間質水腫，中性粒細胞浸潤，肺泡間隔增寬、結構紊亂，表明氣管內滴注LPS的小鼠有明顯的ARDS病理表現(圖1A)。HMB干預2周后腓腸肌HE染色結果顯示，對照組及假手術組小鼠肌束結構完整，肌纖維排列緊密，大小形態正常，未見細胞碎裂、溶解，兩組間無明顯差異；與對照組及假手術組比較，模型組出現肌肉萎縮及不同程度的肌束結構破壞，可見細胞數量減少，肌纖維排列更為疏松，橫截面積減少；與模型組比較，HMB組小鼠腓腸肌損傷程度減輕(圖1B)。

圖1 各組小鼠肺組織(A)及腓腸肌組織(B)病理學表現Fig.1 Pathological appearance of lung tissues (A) and gastrocnemius tissues (B) of mice in each group

2.2 HMB對ARDS相關ICU-AW小鼠骨骼肌力量及SI的影響 各組小鼠造模前抓力值比較差異無統計學意義(P>0.05)；第2、3、4天，與對照組比較，假手術組小鼠抓力值降低(P＜0.05)；第1～16天，與對照組及假手術組比較，模型組小鼠抓力值均降低(P＜0.05)；第3～16天，與模型組比較，HMB組小鼠抓力值均升高(P＜0.05，圖2A)。與對照組比較，假手術組小鼠SI無明顯變化(P>0.05)，模型組小鼠SI則明顯降低(P＜0.05)；與模型組比較，HMB組小鼠SI明顯升高(P＜0.05)，但模型組與對照組及假手術組比較，差異均無統計學意義(P>0.05，圖2B)。

圖2 各組小鼠抓力值(A)及SI(B)比較(n=10)Fig.2 Comparison of grasping force (A) and SI (B) of mice in each group (n=10)

2.3 HMB對ARDS相關ICU-AW小鼠Akt-FoxO3a-MuRF1/Atrogin1信號通路的影響 qRT-PCR檢測結果顯示，對照組及假手術組小鼠腓腸肌組織中Akt、FoxO3a、MuRF1及Atrogin1的mRNA表達水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)；與假手術組比較，模型組小鼠腓腸肌組織中Akt和FoxO3a的mRNA表達水平明顯降低(0.35±0.09vs.1.10±0.12；0.32±0.08vs. 1.04±0.12，P＜0.05)，Atrogin1的mRNA表達水平明顯升高(1.55±0.23vs.0.99±0.24，P＜0.05)，MuRF1的升高趨勢更明顯(2.79±0.27vs. 1.12±0.14，P＜0.05，圖3A)；而HMB干預則逆轉了這一趨勢。Western blotting結果與qRT-PCR結果趨勢一致(圖3B、C)。

圖3 HMB干預對Akt-FoxO3a-MuRF1/Atrogin1信號通路mRNA及蛋白表達的影響Fig.3 Effects of HMB intervention on mRNA and protein expression of Akt-FoxO3a-MuRF1/Atrogin1 signaling pathway

2.4 Akt抑制劑ARQ-092對HMB保護作用的影響造模第5～16天，ARQ-092組抓力值及SI均低于Akt抑制劑對照組(P＜0.05，圖4A、B)。腓腸肌組織HE染色結果顯示，ARQ-092組較Akt抑制劑對照組的細胞數量減少，肌纖維橫截面積縮小，排列疏松(圖4C)。qRT-PCR結果顯示，與Akt抑制劑對照組比較，ARQ-092組Akt及FoxO3a的mRNA表達水平均明顯降低(0.35±0.07vs. 0.97±0.18；0.50±0.10vs. 1.08±0.15，P＜0.05)；Atrogin1及MuRF1的mRNA表達水平均明顯升高(1.49±0.18vs. 1.00±0.08；2.81±0.26vs. 1.39±0.27，P＜0.05，圖4D)。Western blotting結果與qRT-PCR結果趨勢一致(圖4E、F)。

圖4 Akt抑制劑ARQ-092對HMB保護作用的影響Fig.4 Effect of Akt inhibitor ARQ-092 on HMB protection

3 討 論

大量研究表明，膿毒癥是ICU-AW發生發展的主要危險因素，肺部感染相關ICU-AW是導致患者病死率及長期罹病率較高的重要因素[19]。ICU-AW的病死率居高不下，嚴重威脅患者健康，并給家庭及社會造成沉重的經濟負擔，關于ICU-AW的研究已成為近年來研究的熱點。為深入探討ICU-AW的發病機制，本研究采用Files等[12]的方法建立ARDS相關ICUAW小鼠模型，該模型成功復制人類ICU-AW相關肌肉萎縮的一些關鍵特征，包括嚴重的骨骼肌萎縮、與ARDS相關的無力、與肌肉功能下降相關的肌肉收縮蛋白的優先喪失、ARDS消退后的肌肉無力持續存在等，提示該ARDS相關ICU-AW小鼠模型可作為本研究的理想動物模型，為下一步研究ICU-AW的發病機制及治療措施創造了有利條件。

HMB是必需氨基酸亮氨酸的一種內源性代謝物，目前已在人類及動物模型中對HMB開展了深入研究。在動物模型中，HMB可有效減輕膿毒癥引起的膈肌無力及地塞米松誘導的肌肉萎縮[20-21]；在臨床人群中，HMB已被證實可減輕癌癥惡病質、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、獲得性免疫缺陷綜合征、肝硬化及肌肉減少癥患者或虛弱老年人的肌肉萎縮[22-24]。本研究結果顯示，經HMB治療后，ARDS相關ICU-AW小鼠的骨骼肌抓力值明顯升高，表明HMB具有保護骨骼肌功能的作用。另外，本研究還發現，HMB能明顯增加ICU-AW小鼠的腓腸肌質量并升高SI。小鼠腓腸肌組織病理切片顯示，與模型組比較，HMB組肌束中由肌膜圍繞的肌纖維排列更加規則有序，肌纖維及肌束的橫截面積增加，炎性細胞浸潤少，損傷程度更輕，證實HMB治療能減輕ICU-AW小鼠的骨骼肌萎縮，并提高骨骼肌的力量，保護ICU-AW小鼠的骨骼肌，這與上述研究結果一致。

既往研究表明，蛋白質降解與合成失衡是ICUAW骨骼肌萎縮的主要機制之一[25]。當蛋白質降解率超過合成時會導致肌肉萎縮，其中蛋白質降解主要與泛素-蛋白酶體途徑的激活有關[8]。泛素-蛋白酶體系統中的兩種主要標志物Atrogin1及MuRF1的過表達可以促進肌肉蛋白質分解及肌肉萎縮，進而參與ICU-AW的發生發展。因此，深入研究Atrogin1及MuRF1的調控機制，對骨骼肌蛋白降解及ICUAW的防治具有重要意義。FoxO3a是骨骼肌蛋白水解途徑中的重要分子，且能夠通過誘導自噬相關基因表達參與骨骼肌功能的調控[26]，因而受到研究者關注。FoxO3a具有磷酸化及非磷酸化兩種狀態，非磷酸化的FoxO3a能夠上調骨骼肌中的Atrogin1及MuRF1表達，從而加速蛋白降解，引起骨骼肌萎縮，而FoxO3a磷酸化與非磷酸化狀態的轉化受Akt調控，活化的Akt能夠促進FoxO3a由非磷酸化轉為磷酸化狀態，從而通過阻止Atrogin1及MuRF1表達來減輕骨骼肌萎縮[6,27-28]。由此可見，Akt-FoxO3a-MuRF1/Atrogin1信號通路在骨骼肌蛋白降解過程中具有重要作用。本研究采用qRT-PCR及Western blotting評估mRNA及蛋白表達，結果顯示模型組小鼠腓腸肌組織中Akt及FoxO3a的mRNA表達水平明顯下降，磷酸化水平明顯降低，MuRF1及Atrogin1的表達明顯增加，提示ICU-AW小鼠骨骼肌分解代謝水平升高。HMB干預使Akt及FoxO3a的mRNA表達水平及磷酸化水平均有提高，明顯降低MuRF1及Atrogin1的表達，表明HMB可能通過激活Akt/FoxO3a信號通路，促進Akt及FoxO3a的磷酸化，進而抑制MuRF1/Atrogin1介導的骨骼肌分解代謝途徑發揮保護作用。本研究為進一步驗證這一猜想，采用Akt抑制劑ARQ-092進行干預，結果表明ARQ-092能夠逆轉HMB對ICU-AW小鼠的保護作用。

綜上所述，本研究提示HMB可能通過調控Akt-FoxO3a-MuRF1/Atrogin1信號通路在ICU-AW中發揮保護作用，對ICU-AW的防治具有重要價值。本研究的不足之處在于僅在ARDS相關ICU-AW的蛋白質降解方面進行了觀察驗證，初步探索了HMB治療ARDS相關ICU-AW的機制，但缺乏對蛋白質合成、自噬以及細胞凋亡三者之間信號通路的探究，需要后續深入研究予以驗證。