胸腺肽a1聯(lián)合恩替卡韋治療抗乙型肝炎病毒患者對H3K9乙酰化修飾蛋白與Toll樣受體9結(jié)合變化的研究

朱海鵬，杜 巍，曹煥煥，鐘慶楊，殷思純

（東莞市第九人民醫(yī)院感染科，廣東東莞 523000）

我國是肝病大國，據(jù)統(tǒng)計，全國慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者將近一億，而其中尤以廣東省的 HBV 感染率居高，且約20%患者可發(fā)展成重型肝臟疾病[1-2]。因此，探討各種新型HBV 治療方法及治療分子機制一直是臨床重要的研究方向。由于慢性乙型肝炎發(fā)病機制復雜，現(xiàn)階段治療方法也呈現(xiàn)出復雜與多樣性，包括抗病毒治療、調(diào)節(jié)免疫、抗炎和抗氧化、抗纖維化等[3]。近期多項胸腺肽a1（Ta1）聯(lián)合恩替卡韋抗HBV臨床研究顯示，該治療方案可以提高血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）復常率、HBV病毒載量（HBV DNA）轉(zhuǎn)陰率等重要指標，臨床常見不良反應(yīng)少而輕[4-6]。為此，Ta1聯(lián)合恩替卡韋抗HBV治療成為一個重要的臨床治療補充手段，針對其聯(lián)合治療的分子機制也成為一個重要課題。前期工作在研究Toll樣受體10（TLR10）在HBV感染中的作用僅發(fā)現(xiàn)TLR9和TLR10的表達與HBV載量具有相關(guān)性[7]。有文獻報道，組蛋白乙酰化修飾狀態(tài)與多種病毒感染密切相關(guān)[8-9]。本課題組在比較慢性乙型肝炎不同疾病狀態(tài)中外周血CD4+T 淋巴細胞中組蛋白H3K9 在全基因組啟動子區(qū)域乙酰化修飾狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)，TLR9基因的2個序列區(qū)存在H3K9乙酰化修飾調(diào)控，提示TLR9的H3K9乙酰化修飾在慢性乙型肝炎發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮了重要的作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年12月至2019年2月東莞市第九人民醫(yī)院收治的3例慢性乙型肝炎患者為研究對象進行回顧性分析，患者中男性1例，女性2例；年齡18～65歲，平均年齡（36.50±4.50）歲。本研究經(jīng)東莞市第九人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。納入標準：①符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》[10]中慢性乙型肝炎的診斷標準；②初次檢測感染患者；③年齡18～65歲。排除標準：①HBV外其他病毒感染；②存在原發(fā)性肝細胞癌（HCC）或甲胎蛋白（AFP）≥400 ng/mL持續(xù)超過1個月；③因其他疾病需要免疫抑制治療或放療、化療；④妊娠或哺乳期患者。

1.2 研究方法 染色質(zhì)免疫共沉淀及TLR9基因H3K9乙酰化檢測。先抽血收集臨床樣本，然后給予聯(lián)合治療，具體過程如下。抽取患者肘靜脈血5 mL，置于500 μL肝素抗凝管中，于抽血后2 h內(nèi)分離外周血單核細胞（PBMCs），采用抗凝管收集受試者血液樣本。給予患者恩替卡韋（中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準字H20052237，規(guī)格：0.5 mg/片）口服治療，0.5 mg/次，1次/d，治療4周；注射用胸腺素a1（成都地奧制藥集團，國藥準字H20020545，規(guī)格：1.6 mg/瓶）行皮下注射，1.6 mg/次，2次/周，治療4周。全部新鮮樣本分離血液PBMCs，加入細胞裂解液，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min渦旋離心取上清。試劑盒內(nèi)MNase Digestions Buffer重 懸 沉 淀，Micrococcal Nuclease混勻水浴，MNase Stop Solution終止反應(yīng)。蛋白質(zhì)裂解液（Lysis Buffer）重懸沉淀，冰浴、渦旋、離心、收集上清。加入750 μL的DNA 結(jié)合緩沖液（Binding Buffer），加入到DNA Clean-Up柱，以3 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min離心棄上清。將剩余的樣品加入同一個DNA Clean-Up柱，加入750 μL DNA 柱清洗緩沖液（Column Wash Buffer），同法離心棄上清，再次離心。加入50 μL DNA 稀釋溶液（Elution Solution），同法離心收集純化DNA，進行實時熒光定量核酸擴增檢測（qPCR）檢測，引物信息見下文。qPCR的總反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)體系，見表1；qPCR采用兩步法擴增體系，反應(yīng)條件如表1所示，循環(huán)數(shù)為50個循環(huán)，反應(yīng)過程為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸 1 min。

表1 qPCR反應(yīng)的反應(yīng)體系

血清白細胞液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LCMS/MS）檢測組蛋白乙酰化。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)：使用Thermo Fisher公司的血清高豐度蛋清去除試劑盒Pierce? Top 12 Abundant Protein Depletion Spin Columns去除12種常見的高豐度蛋白。使用Thermo Fisher公司檢測蛋白質(zhì)濃度試劑盒Pierce? BCA Protein Assay Kit給蛋白質(zhì)定量。使用AB Sciex公司的iTRAQ 試劑-多標緩沖液試劑盒還原及封閉蛋白質(zhì)。使用Sangon公司的Trypsin TPCK Treated酶解蛋白質(zhì)。使用AB Sciex公司的iTRAQ多重試劑盒標記iTRAQ實驗的蛋白質(zhì)。iTRAQ實驗的蛋白質(zhì)經(jīng)過標記后需要進行第一維高Ph-rp液相分離。iTRAQ實驗和非標記蛋白組學技術(shù)（Label free）實驗都進行RPLC-MS。肽段用樣品溶解液（0.1%甲酸、5 %乙腈）溶解，充分振蕩渦旋，13 500 r/min，4 ℃離心20 min，上清轉(zhuǎn)移到上樣管中，進行質(zhì)譜鑒定；流動相A為0.1%甲酸+2%乙腈水溶液；流動相B為0.1%甲酸+98%乙腈水溶液；流速為600 m/s，每個組分分析時間90 min。采用Proteome Discoverer 2.2進行數(shù)據(jù)庫檢索，見表2。

表2 LCMS/MS檢測第二維液相梯度條件

采用Proteome Discoverer 2.2進行數(shù)據(jù)庫檢索。軟件參數(shù)設(shè)定消化酶為Trypsin，數(shù)據(jù)庫為uniprot-human-filtered-organism Homo sapiens (Human) 。iTRAQ實驗數(shù)據(jù)需要設(shè)定靜態(tài)修飾為8標iTRAQ試劑標記。鑒定的原始結(jié)果設(shè)置MS準確度10 mg/kg，MS / MS準確度0.02 Da，胰蛋白酶消化，允許兩次錯過切割，固定的半胱氨酸的氨基甲酰基甲基修飾和氧化甲硫氨酸的可變修飾。

HBV感染患者在入院第一天、恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治療1個周期、恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治療結(jié)束3個階段中患者血清PBMCc中TLR9基因與蛋白H3K9Ac存在結(jié)合情況、組蛋白修飾水平。

1.3 觀察指標 ①統(tǒng)計3例受試者的臨床血清學指標信息。②分析Ta1聯(lián)合恩替卡韋抗HBV治療過程中TLR9基因的H3K9乙酰化修飾。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3例受試者的臨床血清學指標信息 本研究開始納入了20例患者，因各種患者和疫情影響因素，最終全部治療進程完成的患者只有3例。對納入研究的3例受試者治療不同時間段谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）、凝血酶原活動度（PTA）、HBV病毒載量等實驗室血清學信息進行了統(tǒng)計，見表3。

表3 3例受試者的臨床血清學指標信息（）

表3 3例受試者的臨床血清學指標信息（）

注：ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；TBIL：總膽紅素；PTA：凝血酶原活動度；HBV DNA：乙型肝炎病毒載量。

指標 治療前 治療中 治療后ALT(IU/L) 867.9±108.5231.9±5.7 69.1±17.7 TBIL(μmol/L) 209.3±45.5 116.7±4.4 33.8±6.9 PTA(%) 45.7±9.2 69.9±11.881.5±10.8 HBV DNA(Log10 IU/mL) 9.32±2.3 2.19±1.160.82±0.77

2.2 Ta1聯(lián)合恩替卡韋抗HBV治療過程中TLR9基因的H3K9乙酰化修飾 通過ChIP實驗探究了恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥過程中患者血清PBMCs細胞中，蛋白H3K9Ac與TLR9 基因啟動序列（promoter ）區(qū)的結(jié)合情況。通過序列比對分析，TLR9基因與蛋白H3K9Ac預測的3個潛在結(jié)合位點，分別設(shè)計了對應(yīng)的驗證引物信息，見圖1。

圖1 免疫共沉淀ChiP技術(shù)實驗檢測不同人群血清PBMCc中TLR9基因與蛋白H3K9Ac結(jié)合情況

進一步研究測試了3例HBV感染患者在剛?cè)朐骸⒍魈婵f和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治療一個周期、恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治療結(jié)束3個階段中患者血清PBMCc中TLR9基因與蛋白H3K9Ac存在結(jié)合情況。結(jié)果很明顯，3個結(jié)合位點在治療過程中均有顯著的改變，尤其是位點2，這說明恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥臨床增強免疫、抑制HBV病毒復制的過程中確實與TLR9基因與蛋白H3K9Ac有顯著的關(guān)系。

通過DNA序列分析也發(fā)現(xiàn)H3K9Ac在其他細胞模型中具備同一區(qū)域修飾模型的變化，ChiP檢測的PCR產(chǎn)物經(jīng)過測序我們也找到了TLR9的部門基因序列，在治療好轉(zhuǎn)的過程中起序列匹配度更好。這一點與固定的DNA位點組蛋白修飾的改變進而誘導基因調(diào)控的模型是吻合的，見圖2。

圖2 治療前中后患者免疫共沉淀PCR產(chǎn)物測序數(shù)據(jù)（同一組樣本混合）

此外，本研究通過LCMS/MS技術(shù)也初步探討了HBV感染患者在恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治療過程中血清PBMc細胞組蛋白修飾的程度的變化。如圖3所示，隨著治療進程的增加，可 在uniprot-human-filtered-organism Homo sapiens (Human)可檢索到乙酰化修飾片段增多。這說明恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥增加了組蛋白修飾水平，這可能會促使患者PBMc核內(nèi)的TLR9相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子釋放，增加其表達水平，改變患者免疫水平。

圖3 治療前中后期液質(zhì)LCMS/MS技術(shù)檢測患者血清PBMc中組蛋白乙H3K9酰化水平

3 討論

本研究前期工作中，針對Tolls在HBV感染患者PBMCs上差異表達，發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者血清中PBMCs TLR9 mRNA表達與血清HBV DNA載量具有顯著相關(guān)性。考慮到慢性乙型肝炎患者外周血細胞中TLR9基因的2個序列區(qū)存在H3K9乙酰化修飾調(diào)控。隨后進一步探究了3例慢性乙型肝炎患者恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治不同治療進程過程中H3K9乙酰化蛋白與TLR9的結(jié)合情況。本研究結(jié)果顯示，對納入研究的3例受試者進行恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥，具有顯著的臨床抗病毒效果，并且整個過程中肝功能具有明顯提高。

本研究系統(tǒng)地考察了HBV感染患者在恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治療過程中患者血清PBMc細胞中組蛋白修飾的變化、蛋白H3K9Ac與TLR9結(jié)合情況 ，結(jié)果顯示，TLR9的H3K9乙酰化修飾在慢性乙型肝炎患者中存在并發(fā)揮了重要作用。在恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治療的過程中，TLR9的組蛋白乙酰化修飾顯著提高、H3K9乙酰化蛋白與TLR9結(jié)合位點變化顯著，這可能會增加了TLR9在mRNA和蛋白水平的表達，進一步調(diào)節(jié)各種炎癥因子、細胞因子的表達，進一步抑制病毒增殖、發(fā)揮抗病毒效果。研究結(jié)果證實了TLR9、H3K9乙酰化修飾等參與Ta1聯(lián)合恩替卡韋抗HBV過程的免疫反應(yīng)，為慢性乙型肝炎抗病毒的免疫控制理論提供了新依據(jù)，具有重要的臨床應(yīng)用意義。

綜上，在恩替卡韋和Ta1聯(lián)合用藥治療的過程中兩者的結(jié)合可能會增加TLR9在mRNA和蛋白水平的表達，發(fā)揮其抗病毒作用。