早期剝除卵丘細(xì)胞對凍融單囊胚移植妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局的影響

張卉，王常燕，王玉紅，常文亮，盧靜，景麗，柴亮聽

(1.邯鄲市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，邯鄲 056000；2.邯鄲市第一醫(yī)院檢驗科，邯鄲 056000)

自1978年以來，輔助生殖技術(shù)(ART)取得了極大進步，但常規(guī)體外受精(IVF)后完全受精失敗的可能性仍不可避免[1-2]。在受精16～18 h后采用補救卵胞漿內(nèi)單精子注射(R-ICSI)，雖然能獲得較好的受精率和卵裂率，但因卵母細(xì)胞老化，隨后的胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局并不理想[1]。近年來，縮短精卵共培養(yǎng)時間，結(jié)合早期R-ICSI被認(rèn)為是避免常規(guī)IVF周期中完全受精失敗的有效策略[3]。

卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞生長、成熟、受精和胚胎發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用[4]。然而，為了識別未受精卵母細(xì)胞并進行早期R-ICSI，需要在精卵共培養(yǎng)4～6 h(短時受精)后剝除卵丘細(xì)胞，以確定卵母細(xì)胞中是否出現(xiàn)第二極體[5]。有研究表明，短時受精可以顯著改善受精率、囊胚質(zhì)量和胚胎種植能力[6]，也有研究認(rèn)為早期剝除卵丘細(xì)胞對受精、多精受精、胚胎發(fā)育沒有顯著影響[7]。但大多數(shù)研究均認(rèn)為，在精卵共培養(yǎng)4～6 h剝除卵丘細(xì)胞，可以早期發(fā)現(xiàn)低受精或完全受精失敗。目前，對于早期剝除卵丘細(xì)胞仍沒有共識，且很少有研究探討早期卵丘細(xì)胞剝除對胚胎移植后活產(chǎn)和新生兒結(jié)局的影響。本文旨在研究IVF周期中4 h和16～18 h剝除卵丘細(xì)胞組的正常受精率、多原核受精率、胚胎和囊胚發(fā)育潛力差異，同時探討兩者凍融單囊胚移植后的妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局。

資料與方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2018年1月至2020年12月于邯鄲市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科接受常規(guī)IVF治療的單囊胚解凍移植患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方年齡≤40歲；(2)取卵周期獲得≥4個卵母細(xì)胞；(3)移植胚胎為常規(guī)IVF周期凍融單囊胚；(4)解凍后存活且培養(yǎng)2 h擴張程度達(dá)1/2以上的囊胚。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)ICSI或R-ICSI周期的凍融囊胚移植；(2)患有先天或繼發(fā)子宮異常、宮腔粘連的患者；(3)轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度<8 mm的患者；(4)單囊胚移植后單卵雙胎分娩的患者。

本研究共納入241個周期，根據(jù)卵丘細(xì)胞剝除時間，將患者分為兩組：4 h組(n=116)和16～18 h組(n=125)，4 h組在精卵共培養(yǎng)4 h后剝除卵丘細(xì)胞并進行卵母細(xì)胞第二極體觀察，16～18 h組在精卵共培養(yǎng)16～18 h后剝除卵丘細(xì)胞直接進行原核觀察。4 h組患者至少有一個不受精的高危因素：女方有影響卵母細(xì)胞質(zhì)量的因素(如子宮內(nèi)膜異位癥或多囊卵巢綜合征)、不孕年限≥3年、不明原因不孕。

二、研究方法

1.促排卵方案和卵母細(xì)胞獲取：所有患者均接受控制性卵巢刺激(COS)，COS方案包括促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)長方案、促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRH-ant)方案或微刺激方案。當(dāng)≥3個卵泡直徑達(dá)到18 mm時，肌肉注射5 000～10 000 U的HCG(珠海麗珠)，以觸發(fā)卵母細(xì)胞成熟。HCG注射35～37 h后經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。將采集的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合(COCs)置于G-IVF plus受精培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中，在5% O2、6% CO2的37℃培養(yǎng)箱(Cook，美國)中等待受精。

2.精子制備和受精：在禁欲2～7 d后，取卵當(dāng)日男方手淫取精，精液在室溫條件下液化至少30 min。根據(jù)《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第五版)標(biāo)準(zhǔn)，對精液質(zhì)量進行評估，采用常規(guī)不連續(xù)密度梯度離心法和上游法處理精液，處理后的精子保存在室溫下備用。注射HCG 38～40 h后按照10～20萬條精子/ml受精體系將精子加入COCs所在的G-IVF plus受精液中進行授精。

3.卵丘細(xì)胞剝除：4 h組將精卵共培養(yǎng)4 h，用140 μm剝卵管(Cook，美國)反復(fù)抽吸卵母細(xì)胞，直到移除大部分卵丘細(xì)胞，將受精卵轉(zhuǎn)移到G-1 plus 卵裂培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)微滴中觀察極體情況。若卵母細(xì)胞存在兩個極體判斷為受精，低于30%的受精率屬于低受精，當(dāng)所有卵母細(xì)胞均未出現(xiàn)第二極體時，判定受精完全失敗。低受精或完全受精失敗的患者在授精6 h后進行早期R-ICSI。16～18 h組將COCs與精子共培養(yǎng)16～18 h后剝除卵丘細(xì)胞，直接觀察原核情況。

4.受精、胚胎發(fā)育評估及移植：在卵母細(xì)胞授精約16～18 h后，觀察兩組卵母細(xì)胞是否存在原核(PN)，以確定受精情況。當(dāng)觀察到2PN時，判斷為正常受精；觀察到0PN、1PN或多PN(>2PN)時，判斷為異常受精。多PN受精卵直接丟棄，2PN、1PN或0PN卵裂的受精卵于受精后的1～3 d在G-1 plus卵裂培養(yǎng)液中培養(yǎng)，4～6 d在G-2 plus囊胚培養(yǎng)液(vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)，第3 天可利用胚胎定義為細(xì)胞數(shù)≥6個、細(xì)胞碎片比例≤25%的2PN 胚胎。除外第3天移植及冷凍的胚胎，將剩余2PN 胚胎及所有1PN和0PN 卵裂期胚胎進行囊胚培養(yǎng)。根據(jù)Gardner評分系統(tǒng)對囊胚進行評分，可利用囊胚進行玻璃化冷凍或解凍。

5.內(nèi)膜準(zhǔn)備：如前所述[8]，患者采用人工周期或自然周期準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜。人工周期方案：月經(jīng)第3天起口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳，德國)4～10 mg/d，當(dāng)B超監(jiān)測內(nèi)膜厚度≥8 mm時，肌肉注射黃體酮(浙江仙琚)40～60 mg/d使內(nèi)膜轉(zhuǎn)化為分泌期，轉(zhuǎn)化第6天行凍融單囊胚移植。自然周期方案：于月經(jīng)周期的第8～10天開始B超監(jiān)測卵泡及內(nèi)膜，當(dāng)優(yōu)勢卵泡直徑>14 mm時，同時監(jiān)測血黃體生成素(LH)水平，確定排卵時間，排卵前肌肉注射HCG(珠海麗珠)5 000～10 000 U，卵泡破裂后第5天行凍融單囊胚移植。移植后繼續(xù)給予黃體支持。隨訪所有移植患者的妊娠結(jié)局，直到分娩或流產(chǎn)。

6.臨床結(jié)局判斷：胚胎移植后14 d血清β-HCG≥3 U/L定義為HCG陽性，移植后28 d行B超檢查見妊娠囊及原始心管搏動定義為臨床妊娠。孕28周之前的胚胎丟失或妊娠終止定義為流產(chǎn)。早產(chǎn)(PTB)定義為妊娠前37周的分娩。低出生體重(LBW)為新生兒出生體重<2 500 g。

7.觀察指標(biāo)：兩組患者的基本資料，包括女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、不孕類型、不孕原因以及促性腺激素(Gn)總量、促排卵天數(shù)、平均獲卵數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、移植囊胚期；受精及胚胎發(fā)育情況，包括2PN率、多PN率、囊胚形成率、可利用胚胎率；妊娠結(jié)局，包括HCG陽性率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率及活產(chǎn)率；新生兒結(jié)局，包括新生兒胎齡、早產(chǎn)兒比例、新生兒體重、低體重兒比例、新生兒性別比例和畸形兒比例。

2PN率=2PN卵母細(xì)胞數(shù)/IVF加精卵母細(xì)胞數(shù)×100%；多PN率=>2PN卵母細(xì)胞數(shù)/IVF加精卵母細(xì)胞數(shù)×100%；囊胚形成率=形成囊胚數(shù)/進行囊胚培養(yǎng)胚胎數(shù)×100%，可利用胚胎率=(移植胚胎數(shù)+冷凍胚胎數(shù))/總卵裂數(shù)×100%；HCG陽性率=HCG陽性周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；胎齡=囊胚移植后的天數(shù)+19。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組患者的基本資料

本研究共分析了241個凍融單囊胚移植周期，根據(jù)受精過程中卵丘細(xì)胞剝除時間，將患者分為4 h組(n=116)和16～18 h組(n=125)。分析兩組患者的基本資料，結(jié)果顯示：4 h組不孕年限和原發(fā)不孕比例均顯著高于16～18 h組(P<0.01)，兩組之間的不孕原因也有顯著差異(P<0.05)；兩組患者在女方年齡、BMI和基礎(chǔ)FSH水平方面無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般情況比較[M(P25，P75)，(-±s)，n(%)]

二、兩組患者的促排卵及受精情況

統(tǒng)計結(jié)果顯示，與16～18 h組相比，4 h組Gn總量和可利用胚胎率顯著增加(P<0.05)；而在促排卵天數(shù)、平均獲卵數(shù)、2PN率、多PN率、囊胚形成率、子宮內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案和移植囊胚期方面，兩組間均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

三、兩組患者的臨床結(jié)局比較

兩組患者的HCG陽性率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率及活產(chǎn)率比較均無顯著差異(P>0.05)(表3)。

表2 兩組患者的促排卵及受精情況比較[M(P25，P75)，%，n(%)]

表3 兩組患者的妊娠結(jié)局比較(%)

四、兩組患者新生兒結(jié)局比較

兩組間的新生兒胎齡、新生兒體重、早產(chǎn)兒比例、低體重兒比例以及性別比均無顯著差異(P>0.05)，兩組均無畸形兒出生(表4)。

表4 兩組間新生兒結(jié)局比較[M(P25，P75)，(-±s)，%]

五、早期剝除卵丘細(xì)胞對妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局的影響

通過多因素線性回歸及多因素Logistic回歸分析探討早期剝除卵丘細(xì)胞與妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局之間的獨立關(guān)聯(lián)。在調(diào)整了女性年齡、BMI、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、不孕類型、不孕原因、Gn總量、移植囊胚期、子宮內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案后，兩組患者間的臨床妊娠結(jié)局比較均無顯著性差異(P>0.05)(表5)；新生兒結(jié)局分析中，兩組間的新生兒胎齡、新生兒體重、早產(chǎn)兒比例、低體重兒比例比較也均無顯著性差異(P>0.05)，但4 h組新生兒男性比例顯著高于16～18 h組(P=0.04)(表6)。

表5 早期剝除卵丘細(xì)胞對妊娠結(jié)局影響的多因素Logistic回歸分析

表6 早期剝除卵丘細(xì)胞對新生兒結(jié)局影響的多因素線性/Logistic回歸分析

討 論

卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞發(fā)育和自然受精過程中必不可少，但在ICSI周期中胚胎在沒有卵丘細(xì)胞的情況下能夠正常發(fā)育，這一事實表明，早期剝除卵丘細(xì)胞可能不會影響胚胎發(fā)育。此外，Chen等[9]發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞與精子共培養(yǎng)2～4 h后受精，約90%卵母細(xì)胞在授精6 h出現(xiàn)第二極體。Jin等[10]發(fā)現(xiàn)，在精卵共培養(yǎng)4 h時觀察到第二極體的卵母細(xì)胞中93.3%于授精14～18 h后觀察到受精跡象，其中84.8%表現(xiàn)為正常受精；如果在早期卵丘細(xì)胞剝除過程中未觀察到第二極體排出，可進行早期R-ICSI，與晚期R-ICSI相比，早期R-ICSI可獲得更高的受精率和更具有發(fā)育潛力的胚胎。

既往研究表明，原發(fā)不孕和較長的不孕時間是完全受精失敗的高危因素[11]，不明原因不孕患者完全受精失敗的發(fā)生率也較高[12]。本研究將這些原因?qū)е虏辉械幕颊呒{入4 h組，必要時進行早期R-ICSI。因此，4 h組與16～18 h組在原發(fā)不孕率、不孕持續(xù)時間、不育原因等方面存在顯著差異。與16～18 h組相比，4 h組Gn總量顯著增加，這可能是由于4 h組患者卵巢功能反應(yīng)欠佳所致。

早期剝除卵丘細(xì)胞對多精受精的影響仍存在爭議。受精早期較晚期剝除卵丘細(xì)胞更困難，同時，在受精早期，卵母細(xì)胞由于紡錘體和微管的活躍而更加脆弱，重復(fù)性的抽吸可能會對卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性造成不利影響，從而損傷其多精受精的保護機制[13]。已有研究顯示，早期剝除卵丘細(xì)胞后多PN率顯著增加[14]。然而，也有研究報道，短時受精并沒有增加多PN率[13]。有學(xué)者觀察到早期剝除卵丘細(xì)胞后正常受精率顯著降低[15-16]。我們的研究顯示，4 h組的多PN率增高，而2PN率降低，盡管兩組之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但仍有一定的變化趨勢，這一結(jié)果與之前的報道[7]一致。卵丘細(xì)胞為卵母細(xì)胞提供了一系列在卵母細(xì)胞成熟、受精和發(fā)育中發(fā)揮重要作用的物質(zhì)[17]。但我們的結(jié)果顯示，4 h組的可利用胚胎率顯著高于16～18 h組，這可能是由于隨著共培養(yǎng)時間的延長，卵丘細(xì)胞和精子產(chǎn)生的有毒代謝物會對胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利影響[18]。然而，也有報道認(rèn)為早期剝除卵丘細(xì)胞并不影響胚胎的活力、質(zhì)量以及臨床結(jié)局[19-20]。產(chǎn)生這些矛盾結(jié)果的原因可能是研究設(shè)計和患者的異質(zhì)性。卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞的受精結(jié)局有利有弊，其確切性質(zhì)有待進一步研究證實。

關(guān)于受精過程中早期剝除卵丘細(xì)胞對臨床結(jié)局和新生兒結(jié)局的影響，一項前瞻性隨機對照研究顯示，與20 h組相比，4 h剝除卵丘細(xì)胞對新鮮胚胎移植周期的HCG陽性率和臨床妊娠率無不良影響[21]。另一項回顧性研究也表明，在年齡小于40歲的患者中，與常規(guī)卵丘細(xì)胞剝除相比，早期卵丘細(xì)胞剝除對臨床妊娠、流產(chǎn)和活產(chǎn)率沒有不利影響[22]。本研究中，4 h組與16～18 h組的凍融單囊胚移植結(jié)局比較，在HCG陽性率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。上述數(shù)據(jù)表明，在新鮮胚胎移植和凍融單囊胚移植周期中，受精過程中早期卵丘細(xì)胞剝除可能對妊娠結(jié)局沒有不利影響。

目前，關(guān)于早期卵丘細(xì)胞剝除對新生兒預(yù)后的研究還很有限。已有研究發(fā)現(xiàn)，4 h和20 h剝除卵丘細(xì)胞組的新鮮胚胎移植后單胎和雙胎的新生兒在出生體重、早產(chǎn)率、新生兒性別比例等方面相似[22]。尚未有文獻(xiàn)對早期剝除卵丘細(xì)胞后的凍融胚胎結(jié)局進行研究，本文針對凍融單囊胚移植，分析了胚胎移植后的單胎妊娠和新生兒結(jié)局。研究結(jié)果顯示，排除混雜因素干擾后，兩組間新生兒胎齡、早產(chǎn)兒比例、新生兒體重及低體重兒比例比較均無顯著差異(P>0.05)，兩組均無重大畸形兒出生，但4 h組中男性新生兒比例顯著高于16～18 h組(P=0.04)，提示早期剝除卵丘細(xì)胞可能會增加凍融單囊胚移植后男性新生兒的出生比例。

本研究的主要優(yōu)勢在于探究了早期卵丘細(xì)胞剝除后凍融周期囊胚移植的臨床妊娠和新生兒結(jié)局。由于雙胎妊娠與不良妊娠和新生兒結(jié)局的風(fēng)險增加相關(guān)，因此本研究只納入了單囊胚移植及單胎新生兒出生的病例，排除了多胎妊娠產(chǎn)生的不利影響；此外，本研究進行了回歸分析，盡量減少與妊娠和新生兒結(jié)局可能相關(guān)的混雜因素。但本研究也存在一定的局限性：首先，作為一個回顧性分析，數(shù)據(jù)收集來自病歷記錄，不能排除所有可能影響研究結(jié)局的自變量因素；其次，研究數(shù)據(jù)來自單中心，納入的周期數(shù)較少，出生的新生兒數(shù)量也相對較少。因此，后期需要進行多中心前瞻性研究，以消除混雜因素的影響。

綜上所述，在凍融單囊胚移植周期中，受精過程中早期剝除卵丘細(xì)胞對妊娠結(jié)局和除新生兒性別比以外的新生兒結(jié)局沒有顯著影響。對于有不受精高危因素的患者，可以選擇早期卵丘細(xì)胞剝除聯(lián)合早期R-ICSI。但尚需對早期剝除卵丘細(xì)胞后新生兒性別及新生兒長期隨訪進行關(guān)注，進一步驗證早期卵丘細(xì)胞剝除的安全性。