冷凍卵巢組織移植研究進展

華蓬勃，楊怡卓，李芳菲，彭紅梅*

(1.北京市門頭溝區婦幼保健院，北京 102300；2.中國人民解放軍總醫院第一醫學中心，北京 100039)

不孕癥目前已成為繼癌癥、心血管疾病的第三大疾病，全球包括我國的患病率逐年增高，其中卵巢因素導致不孕是主要原因之一。卵巢早衰、卵巢先天發育異常、婦科惡性腫瘤放化療后導致卵巢不可逆的損傷、其他系統惡性腫瘤全身治療后卵巢無功能等導致越來越多的年輕患者失去生育能力及面臨內分泌失調等問題，從而給自身及家庭的生活帶來壓力。目前保存生育力的方式有卵子冷凍、胚胎冷凍、卵巢移植等，其中胚胎冷凍及卵子冷凍已相對成熟[1]，而卵巢移植與其他兩種方法相比，有其特有的優勢，不僅可以為年輕患者保留生育功能，還可以解決其內分泌相關問題。

隨著器官移植技術的飛速發展，卵巢移植是逐漸興起的一種挽救卵巢早衰、卵巢惡性腫瘤等年輕患者生育能力的手段。但目前卵巢移植臨床實踐應用中仍面臨諸多問題，例如移植后大量卵泡的丟失導致卵巢壽命較短甚至移植后卵巢無功能、異體移植術后因免疫排斥反應可能需要長期口服免疫抑制劑以及倫理問題等諸多因素，均限制了卵巢移植的進展，需要更多的臨床研究推動卵巢移植的發展。本文綜述了冷凍卵巢組織移植的研究進展，包括卵巢組織移植的類型、移植部位的選擇、如何改善移植成功率、移植后的免疫抑制劑的應用等。

一、卵巢組織移植的類型

卵巢移植類型包括：自體移植、同種異體移植、異種移植。

1.自體移植：對于惡性腫瘤需要全身放化療的患者，可以在治療前進行卵巢組織冷凍，在放化療結束后進行自體卵巢移植。其優點為無免疫排斥反應、無需使用免疫抑制劑、術后并發癥少，但對于卵巢無功能的患者或患有某些惡性腫瘤，其卵巢組織中存在惡性腫瘤的患者等均無法行自體移植。2021年我國首例骨髓異常增生綜合征的患者在骨髓移植后進行自體卵巢移植，術后3個月恢復自然月經，術后1年余后順利妊娠并分娩活嬰[2]，為自體卵巢移植的發展奠定了基礎。

2.同種異體移植：對于卵巢早衰、無功能的患者，或患有某些惡性腫瘤，其卵巢組織中存在惡性腫瘤的患者等，均無法進行自體移植。此類患者要想解決內分泌及生育需求，可以進行供卵-體外受精胚胎移植以及激素替代治療。但是對于存在激素替代治療禁忌癥的患者，可以考慮異體移植，同時解決內分泌以及生育需求。我國1996年陳誦芬等[3]對1例男性假兩性畸形患者行同種異體卵巢移植術，患者術后3個月月經來潮，術后1年卵巢仍存在功能。2009年Silber[4]對其中一人患有卵巢早衰的10對單卵雙胎姐妹進行了研究，雙胎姐妹間的同種異體卵巢移植讓卵巢早衰姐妹獲得了10次自然妊娠，最終7例活產。此研究的成功，為單卵雙胎的姐妹之一出現卵巢功能衰竭提供了較好的治療方案，既可以恢復卵巢功能，又避免了長期口服免疫抑制劑以及激素替代治療。但對于想要對無血緣關系的患者間進行異體卵巢移植，均需面臨長期口服免疫抑制劑以及倫理等相關問題。

3.異種移植：目前尚無人類相關的異種卵巢組織移植相關報道。

2021年Dolmans等[5]回顧了歐洲五大中心285名婦女冷凍卵巢組織移植的結局，幾乎所有接受自體卵巢組織移植的婦女都能看到內分泌功能的恢復，大約25%的婦女會生下一個健康的孩子。這些研究數據，標志著生殖技術的飛速發展，且捐贈器官愛心人士較前明顯增多，均為卵巢移植的發展奠定了基礎。

二、冷凍卵巢組織移植部位的選擇及方法

卵巢移植的部位可以分為兩大類：原位移植以及異位移植。無論是自體移植、同種異體移植以及異種卵巢移植，移植部位的選擇及方法是一致的。

1.原位移植：將卵巢組織移植回至原始卵巢所在的盆腔中，稱原位移植。原位移植的卵巢組織被重新植入其原來的生理環境中，更有利于卵泡的生長發育，且可不需要輔助生殖即可自然受孕，如需促排、取卵、體外受精等輔助生殖操作也更容易簡便。但也有其劣勢所在，如患者盆腔粘連較重，將導致手術困難甚至無法進行原位移植。卵巢組織的原位移植一般在術后 2～9個月可檢測到卵巢活性，最多可持續7年之久，此類研究已獲得多個成功妊娠的案例[6]。

卵巢組織原位移植常見的部位為卵巢表面原位移植、闊韌帶腹膜口袋移植等。卵巢表面原位移植要求患者至少存在一側卵巢，可將患者卵巢皮質層切開，暴露髓質的整個血管網絡，將卵巢皮質用7-0或8-0 propylene線固定，或簡單放置在卵巢髓質上，表面覆蓋Interceed[7]。2011年Donnez等[8]報道了一例特納綜合征患者進行同種異體雙胞胎卵巢皮質原位移植，移植后3個月實現卵巢功能恢復，常規周期7個月后，發生自然妊娠，孕38周時分娩了一名體重2 850克的健康女嬰。

如患者無雙側卵巢可行闊韌帶腹膜口袋移植，在闊韌帶前葉做一個腹膜窗口，可見血管網區域，供者皮質碎片放置在窗口中，隨后覆蓋Interceed[9]。

2.異位移植：將患者卵巢組織移植到盆腔以外的部位，稱為異位移植。其手術操作簡單，對于盆腔粘連較重的患者或惡性腫瘤放療后盆腔血供條件較差的患者，均無法行原位移植，可行異位移植。但異位移植也有其劣勢所在，其生存的微環境不利于卵泡的生長發育以及恢復卵巢功能，且術后無法自然受孕，均需進行輔助生殖。

卵巢皮質異位移植常見部位為前臂、大腿、腹直肌與鞘之間等。2001年Oktay等[10]報道了2例惡性腫瘤患者進行卵巢皮質異位移植到前臂的成功的案例。因當時缺乏大齡患者的卵巢組織冷凍技術，所以在放化療前將患者的卵巢皮質自體異位移植至前臂，避開放療區域后進行放化療，成功保留了患者的內分泌功能。具體方法：將切除卵巢制備成16條卵巢皮質，在腕橈肌前窩下方5 cm處做一個1 cm的垂直切口，采用縫合拉穿技術在皮下插入卵巢帶。2012年Kim[11]報道了5名癌癥患者卵巢組織異位移植的壽命研究，用3-0 Vicry縫線將8～10片卵巢皮質貫穿于線上，局麻下切開皮膚約2 cm切口移植到腹直肌與和鞘之間，進行患者內分泌的監測，最長維持了7年。

因異位移植將會有空卵泡的大量產生、卵泡的停止發育、受精率的降低等等問題，其原因可能與環境溫度的不同、血供的不同等相關，截止至目前研究報道異位移植后活產率很少。2015年Youm等[12]分析比較了小鼠卵巢移植的原位移植及異位移植，結果表明原位移植的卵泡存活多，移植成功率更高。

三、添加外源性物質來改善移植的成功率

冷凍卵巢組織移植成功率受多種因素的影響，其中最重要的是冷凍及移植過程中卵泡的丟失的問題。卵巢組織移植后，局部缺血可持續3～7 d，這種缺血導致的卵泡丟失仍然是目前卵巢組織移植面臨的嚴峻問題。移植后決定卵巢壽命的重要因素是存活下來的原始卵泡的數量[13]，而冷凍卵巢皮質中較多休眠卵泡在移植后丟失，因此盡可能在此時期減少卵泡的損傷至關重要[14]。隨著國內研究的進展，冷凍卵巢組織移植后卵巢功能恢復的成功率以及之后的妊娠率及活產率均較以往明顯上升[15]，為卵巢冷凍移植技術的發展打下了基礎。為盡量減少冷凍以及移植過程導致卵泡的丟失，可增加外源性物質來改善移植的成功率。既往有多項研究報道，具體如下。

1.生長因子：卵巢皮質移植因沒有血管吻合，移植后的存活與否在于血運重建，所以移植后加快血運重建、減少組織缺氧時間可以減少卵泡的丟失。目前有多種生長因子可以促進血管的生成，研究較多的有血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等。

VEGF是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，具有促進血管通透性增加、細胞外基質的變性、內膜細胞的遷移、增殖和血管形成等作用。VEGF是一個家族，VEGF-A是其一員，可以促進新生血管形成和使血管通透性增加，為一種有效的血管生成因子，進而提高移植卵巢組織的卵泡存活率[16]。bFGF一般由巨噬、平滑肌、內皮細胞分泌，bFGF可以促進血管的生成。bFGF可以增加卵巢組織CD31表達，使同種異體移植卵巢組織中卵泡密度明顯增加[17]。2013年有研究將小鼠進行同種異體卵巢移植后使用VEGF、bFGF以及兩種生長因子聯合，觀察對卵泡的存活及血管重建的作用，結果表明單獨使用bFGF或VEGF均可以促進卵巢血管的重建，兩種生長因子聯合應用效果更佳[18]，可以使血管的密度與卵泡數量明顯增多，兩種生長因子起到了協同的作用。

2.激素因子：在卵巢組織移植過程中，多項研究表明各種激素的使用對卵泡的存活也發揮了很好的保護作用，包括卵泡刺激素(FSH)、雄激素、人絕經期促性腺激素(HMG)、抗苗勒管激素(AMH)、黃體生成素(LH)等。在移植前用FSH或HMG培養卵巢組織，可使移植后卵巢組織的VEGF和bFGF的表達增強及血管密度增加，從而提高卵泡生存率[19]。AMH在控制性分化和卵泡發育起關鍵作用[20]，雖然AMH長期以來作為卵巢儲備的一個重要指標，但最近也被作為一種保護劑研究[21]。有研究表明使用AMH可以明顯減少卵巢移植后的卵泡丟失[22]。既往有研究報道小鼠的卵母細胞在雄性受體中可以成功受精后活產，雄性小鼠體內的激素環境可以支持具有發育能力的卵母細胞的生長[23]。而在人類卵巢移植中，雄激素的應用還沒有相關報道，需進一步研究。2020年Zheng等[24]報道LH可通過在卵巢冷凍保存和移植過程中上調VEGF、Cx43和Cx37的表達來促進卵巢的存活和功能。

3.1-磷酸鞘氨醇(S1P)：S1P是一種抑制凋亡的因子，抑制放化療引起的細胞凋亡[25]。2011年有研究報道S1P對人卵巢移植后早期血管生成的影響，結果表明S1P可以增加血管的密度、促進血管的生成，進而改善人卵巢皮質組織移植過程中的原始卵泡存活率[26]。也有研究報道對冷凍卵巢移植的小鼠進行S1P干預，發現進行S1P干預的小鼠原始及初級卵泡較多，抵抗移植對卵巢的損傷，降低了移植后卵泡凋亡的發生率[27]。還有研究提出，卵巢玻璃化凍存過程 中FSH 聯合 S1P的干預可抑制卵泡閉鎖[28]。

4.間充質干細胞(MSCs)：MSCs通過釋放血管生成因子、分化多種組織細胞，在支持新血管生成和穩定方面起重要作用。MSCs可以提高VEGF、血管生成素的水平，刺激新血管形成，并增加冷凍保存的卵巢組織移植后的血液灌注，明顯降低原始卵泡的死亡率從而減少了卵泡的丟失[29]。有研究在大鼠卵巢自體移植過程中加入脂肪MSCs后，原始卵泡及卵泡總數均較無添加卵巢移植組增多，而細胞凋亡數目減少，表明大鼠脂肪MSCs可以改善卵巢移植的成功率，延長移植后的卵巢壽命[30]。異體移植尚未見相關報道，但異體移植可考慮使用MSCs提高移植成功率。

5.富含血小板的血漿(PRP)：PRP中血小板濃度非常高，其生長因子濃度可為血漿的3～5倍，其中的各種生長因子在細胞分化與增殖中起著非常重要作用，還可以促進血管的生成[31]。在既往不同的研究中，各種醫學領域均有應用PRP來促進血管生成并取得成功的案例。富含血小板的纖維蛋白(PRF)是一種富含血小板的血液衍生物。PRF釋放細胞因子，可以誘導血管生成，抑制氧化應激、細胞凋亡和炎癥，從而減少缺血再灌注損傷。2019年國外有研究對自體卵巢移植的小鼠在移植部位使用PRF生物支架，結果顯示其細胞凋亡率和炎癥因子濃度顯著降低[32]。

6.抗氧化因子：內源性抗氧化因子可以中和在缺血應激期間過量產生的氧自由基。目前應用的外源性抗氧化劑有抗壞血酸、褪黑素、維生素C、維生素E等，能減輕一定的程度的血管內皮損傷，但目前應用有限，有較大的爭議[29]。褪黑素在線粒體水平上具有抗炎及抗氧化作用，2021年國外有研究將雌性大鼠的卵巢進行褪黑素介質中冷凍，與標準冷凍法相比，卵巢移植的質量更高[33]，關于生育能力的影響有待進一步研究。

四、異體卵巢組織移植后的免疫抑制劑的應用

自體卵巢組織移植或單卵雙胎姐妹間的異體卵巢組織移植因無免疫排斥反應，無需使用免疫抑制劑。但無血緣關系患者間的異體卵巢組織移植及異種卵巢組織移植，因免疫排斥反應必然存在，均需長期口服免疫抑制，所以免疫抑制劑的應用是保證移植成功的關鍵因素之一。由于卵巢并非人體救命的器官，而免疫抑制劑又均有各種毒副作用，進而限制了人類異體卵巢移植的進展。最理想的移植方案應該是安全的，確保受者可以長期接受供體的卵巢，恢復內分泌功能及完成生育需求。那么安全有效的免疫抑制劑的應用，顯得非常重要。雖然目前沒有成熟的免疫抑制方案應用于卵巢移植，但目前國內外肝臟以及腎臟的移植非常普遍，免疫抑制劑應用非常成熟，且均有較多肝、腎臟移植后患者成功妊娠活產的案例。

目前臨床應用的免疫抑制劑大致分為6類：細胞因子合成抑制劑，包括環孢菌素(CsA)、他克莫司(FK506)、雷帕霉素(RAPA)等；DNA合成抑制劑，包括硫唑嘌呤(AZA)、霉酚酸酯(MMF)、咪唑立賓(MZR)等；腎上腺皮質類固醇藥物，如甲基強的松龍、強的松等；抗淋巴細胞抗體類藥物，如甲氨蝶呤、環磷酰胺等；植物藥類，包括FTY720、雷公藤多苷等。由于目前已發表的關于人類的同種異體卵巢移植研究較少，免疫抑制劑應用經驗不足，尚無統一意見。

1.環孢菌素A(CsA)：在1987年有研究對大鼠進行卵巢輸卵管同種異體移植，使用CsA作為免疫抑制劑，術后成功產下后代[34]。在1993年有研究對兔子進行同種異體卵巢移植，同樣將環孢素作為免疫抑制劑，應用環孢菌素組與未應用組比較，存活率及成功率明顯升高[35]。其主要毒副作用為腎毒性、高血糖、高血壓、高血脂等。

2.他克莫司(FK506)：作用機制與CsA類似，目前已成為腎移植、肝臟移植受體的主要免疫抑制劑。2020年我國發表的12例腎移植患者術后成功妊娠，孕期的免疫抑制方案為他克莫司和潑尼松以及硫唑嘌呤，分娩的新生兒均無出生缺陷，隨訪一年余，子代的生長及心理發育、學習能力及智力與同齡人均無明顯差異[36]。其主要毒副作用有高血壓、頭痛、低磷血癥、震顫、骨質疏松等。

3.霉酚酸酯(MMF)：可選擇性抑制T、B淋巴細胞的增殖和功能。2020年國外報道了2例恒河猴子宮異體移植后成功恢復功能，應用了霉酚酸酯(MMF)、環孢菌素以及他克莫司免疫抑制治療，術后無排異反應，2個月后恢復月經[37]。其主要毒副作用為敗血癥、感染、白細胞降低等。

4.腎上腺皮質激素：具有溶解免疫活性細胞、阻斷細胞分化從而達到抗炎、抗免疫的作用。我國早在1996年發表了一例人類卵巢成功移植的案例報道[3]，研究中是一位男性假兩性畸形患者進行異體卵巢移植，使用的免疫抑制劑為環磷酰胺、地塞米松及強的松，術后未出現排異反應，1年后卵巢功能仍正常。其主要副作用為骨質疏松、電解質紊亂、高血壓、高血糖、肌肉萎縮等。

5.免疫調節劑胚胎植入前因子(PIF)：PIF也可以防止器官排異反應并且恢復器官功能[38]。PIF是一種由活胚胎分泌的肽，該肽的功能包括無抑制的免疫調節和無排斥的移植接受。2018年有研究采用PIF作為單一療法使進行同種異體卵巢移植的狒狒成功恢復了卵巢功能[38]，但其狒狒為野外獲得，不除外其遺傳的相關性，需要更多的實驗研究證實其可行性。

五、小結與展望

卵巢移植技術可以讓患者獲得生育以及內分泌功能，但仍有很多需要待解決的問題，例如如何減少卵泡丟失而提高移植后卵巢的長期功能，如何更好地使用免疫抑制劑，既能達到抗免疫排斥反應，又能減輕患者以及后代的影響。目前卵巢組織移植仍然是一種正在發展中的技術，但深入的研究可能會將這項技術發展成一種成熟的保護生育能力的方法。